Определяне на глюкозата чрез глюкозооксидазен метод

Анализи

Определянето на концентрацията на глюкоза в кръвта е едно от най-често провежданите биохимични изследвания в лаборатории.

Глюкозооксидазният метод за определяне на глюкоза в кръвта и урината се основава на реакцията на глюкозно окисление в присъствието на ензима глюкоза оксидаза с образуването на водороден пероксид, който на свой ред в присъствието на пероксидаза окислява ортотолидин до оцветяване на продукти; o Концентрацията на глюкоза се обещава от количеството на оцветените продукти.

Тъй като методът на глюкозооксидазата е насочен към идентифициране на глюкоза, а не към всички видове захари, тя се използва в диференциалната диагноза на следните заболявания:

Принципът на глюкозооксидазния метод за определяне на глюкоза

Глюкозата в присъствието на ензима глюкоза оксидаза се окислява от атмосферния кислород до образуване на водороден пероксид по време на реакцията. Водородният пероксид в присъствието на ензим пероксидаза окислява ортотолуидин, за да образува оцветено съединение, чийто интензитет на цвета е пропорционален на съдържанието на глюкоза. Този метод ви позволява да определите нивото на глюкоза в кръвната плазма, серума и цереброспиналната течност.

Нормална кръвна захар, mmol / l

- в плазмата, в natsheartse

новородени - 1.7 - 4.2
деца от 6 седмици до 15 години - 3.3 - 5.4
възрастни (мъже, жени) - 3.9 - 5.6

- в серум, в natsheartse

новородени - 2.6 - 4.2
деца от 6 седмици до 2 години - 3.3 - 5.4
възрастни (мъже, жени) - 3.9 - 5.6

Необходими реагенти за определяне на глюкозата чрез глюкозооксидазен метод

1. Натриев хлорид 9 грама / литър (изотоничен разтвор): приготвя се чрез разтваряне на 0,9 g NaCl в 100 ml вода.

2. Цинков сулфат, 50 g / l: 5 g цинков сулфат (ZnSO4) се разтварят във вода, обемът се довежда до 100 ml.

3. Натриев хидроксид, 0,3 mol / l: приготвен чрез разтваряне на 1,2 g NaOH в 100 ml вода, концентрацията се проверява чрез титруване (трябва да е 0,3 n).

4. Ортотолуидин, 1% разтвор: 1 g от лекарството се разтваря в 100 ml абсолютен алкохол. Разтворът може да се съхранява в хладилник в колба със стъклена запушалка в продължение на няколко месеца. Търговски продукт може да бъде пречистен чрез прекристализация, за която се разтваря в абсолютен алкохол, прибавя се вода и утаените кристали се изсмукват върху филтър, след това се сушат над калциев хлорид.

5. Ацетатен буферен разтвор pH 4.8: смесете 4 части 0.25 n оцетна киселина (проверете чрез титруване) и 6 части 0.25 n натриев ацетат (съдържа 34 g CH3COONa X ZN2O в 1 литър).

6. Глюкозооксидазата е сух препарат с активност от 3000 единици / mg или повече.

7. Пероксидаза от хрян. 1 mg се разтваря в 5 ml ацетатен буфер, може да се съхранява в хладилник в продължение на няколко дни.

8. Работен реактив: разтварят се 2 mg глюкозооксидаза и 1 mg пероксидаза в 80 ml ацетатен буфер, добавят се 1 ml 1% разтвор на ортотолуидин, смесват се и се довежда до 100 ml с буферен разтвор. Работният реагент трябва да бъде прозрачен, безцветен или да има слаб зелен оттенък, в който случай той е стабилен, когато се съхранява на студено. Ако цветът е силен или след няколко часа след приготвянето, утайката започва да пада, това означава, че ортотолуидинът не е достатъчно чист и трябва да бъде прекристализиран.

9. Калибриране на разтвори на глюкоза. Глюкозата се суши предварително при 37 ° С и се съхранява в ексикатор. Първо се приготвя основен разтвор с концентрация 50 mmol / 1, за което 180 mg от веществото се разтваря в 20 ml наситен разтвор (приблизително 0,3%) бензоена киселина. От този разтвор се приготвят работещи калибровъчни разтвори, съдържащи 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 mmol / l, за които те приемат 0,6; 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3,6 и 4,2 ml от основния разтвор и наситен разтвор на бензоена киселина се довежда до обем от 10 ml. Тези разтвори съдържат глюкоза в същите концентрации, каквито се срещат в кръвта, което улеснява изчисленията по време на калибрирането.

Напредък в определянето на глюкозата чрез метода на глюкозооксидазата

В центрофужните епруветки се добавят 1,1 ml разтвор на натриев хлорид, 0,4 ml разтвор на цинков сулфат и 0,4 ml 0,3 N разтвор на NaOH, разбърква се; в същото време се образува много тънък цинков хидроксиден гел, в него се освобождава 0.1 ml кръв или калибриращ разтвор, смесва се отново и се центрофугира след 10 минути при скорост 3000 rpm за 10 минути.

Към 1 ml супернатант се добавят 3 ml от работния реагент и се разбърква внимателно.

Цвят постепенно започва да се развива, който при нормална стайна температура достига максимум за 13-15 минути, а след това постепенно намалява. Фотометрично винаги след същия период от време след добавяне на работния реагент в кювети с дължина на оптичния път 1 сантиметър с червен светлинен филтър (дължина на вълната 625 nm) срещу празен опит, който се задава едновременно с работните образци, но вместо с кръв, вземете физиологичен разтвор на натриев хлорид.

Когато се изготвя калибрационната графика, вместо кръвни проби се взимат 0,1 ml от подходящия калибрационен разтвор.

Изчисляването на глюкозата може да се извърши съгласно правилото за пропорциите или калибрационния график, за да се изчисли концентрацията на глюкоза (mmol / l) върху една ос и стойността на екстинкцията е от друга.

Забележки относно метода за определяне на глюкоза чрез глюкозооксидазна метод

1. Първо можете да освободите кръвта от пипетата в изотоничен разтвор на натриев хлорид и след това да добавите разтвори на цинков сулфат и NaOH.

2. При систематична работа не е необходимо постоянно да се изгражда калибрационен график за всички точки, достатъчно е да се обработи празна проба и 2-3 точки дневно в диапазона 3-9 mmol / l, и да се изгради пълен график за калибриране само при смяна на реагентите или коригиране на процедурата.

Метод на глюкозооксидаза за определяне на глюкоза

Глюкозооксидазният метод се използва за определяне на концентрацията на глюкоза изключително в различни телесни течности. Предимството на този тест е неговата точност. Диагностиката, за разлика от бързите методи, позволява да се разкрие количеството чиста глюкоза, без каквато и да е фруктоза и други захари. Принципът на тази реакция е оцветяване на разтвора, който се получава в резултат на взаимодействието на окислители със специфични багрила. Оценката на резултатите от изследванията се извършва по метода на колориметрията и сравняване със стандартни разтвори.

Кога е предписан методът на глюкозооксидазата?

Този тест се използва за откриване на нарушена толерантност към захарта и развитието на преддиабет, както и на височината на заболяването. Но анализът рядко се използва за такива цели, това се дължи на високата му цена и дългото чакане на резултата. Най-често определянето на глюкозата в кръвта и урината с този метод се използва при диференциалната диагноза на заболявания като:

синдром на непоносимост към лактоза;
фруктозна непоносимост;
освобождаване на фруктоза с телесни течности;
повишена концентрация на пентоза в урината.

Безспорното предимство на теста за глюкозна оксидаза е неговата точност.

Какво е основата на този метод?

Съществуват различни методи за определяне на концентрацията на глюкоза в кръвта, но най-точна е глюкозната оксидаза. Долната линия е, че взаимодействието на захарта с кислорода във въздуха окислява реагента. В разтвора се освобождава водороден пероксид. Това вещество взаимодейства с ортотолуидин, образувайки оцветено съединение. За поведението на тази реакция се изисква наличието на специални ензими. Глюкозооксидазата трябва да присъства в окислителната реакция и пероксидазата в оцветяването на течността. Интензивността на цвета на разтвора ще зависи от съдържанието на глюкоза и ще бъде най-интензивна със своето високо съдържание.

Същността на глюкозооксидазния метод за определяне на глюкозата

Оценката на резултата се осъществява с помощта на количествения метод на фотометрия в същия интервал от време. Не забравяйте да използвате калибриращ разтвор, който съдържа определена честота на захар и от него можете да прецените концентрацията на глюкоза в телесните течности, често в кръвта.

Как се прави анализът?

Материалът се взема от пациента на празен стомах. За теста се използва венозна кръв в количество от 5 ml. В навечерието на диагнозата на пациента се показва строга диета. Това ще позволи да се прецени надеждността на резултата и да се изключат възможни грешки в анализа. 2 дни преди изтеглянето на кръвта, пациентът трябва да се откаже от лошите навици за пиене и пушене. Необходимо е също да се ограничи приема на прекалено сладки ястия и, ако е възможно, да се избягват стресови ситуации.

Най-често този метод за определяне на концентрацията на глюкоза се извършва чрез метода на центрофугиране, който се използва за разделяне на оформените елементи. Количеството захар се определя в плазмата. Когато към него се добавят всички необходими реагенти, цветът се наблюдава след 20 минути, ако изпитването се извършва при стайна температура. Изчисляването на нивото на глюкозата се извършва съгласно графика за калибриране или като се използва правилото за части.

Реагенти за изследвания

За да се определи захарта е най-удобно да се използват бързи методи за определяне на глюкоза в кръвта. Това се дължи на лекотата на използване и бързите резултати. Освен това пациентът не трябва да ходи в лабораторията или болницата. Но за разлика от теста за глюкозооксидаза, такава диагноза е ненадеждна. Тъй като не диференцира глюкозата от други захари и определя тяхната концентрация заедно.

В основата на глюкозооксидазната реакция е натриев хлорид 9% разтвор и цинков сулфат 50%. Те се добавят на етапа на центрофугиране на кръвта. В допълнение, използвайте буферен разтвор с оцетна киселина и натриев ацетат. Методът на титруване определя неговото рН при 4,8. След това се добавя глюкозооксидаза, която причинява водороден пероксид и пероксидаза, която участва в оцветяването на разтвора до желаната концентрация, за да се получи точен резултат.

Стандарти по време на анализа

Количеството захар се измерва в специални единици - милимоли на литър разтвор.

Трябва да се извършат изследвания на кръвта на глюкоза оксидаза на празен стомах и за това се използват плазма или серум. Процентът на неговия брой за възрастни както за жени, така и за мъже е 3.3-5.5. За деца под 15-годишна възраст тази цифра е малко по-ниска и варира между 3,2 и 5,3. При новородени, кръвната глюкоза е 1,7–4,2. Увеличаването на показателите се наблюдава при развитието на пациент със захарен диабет или в нарушение на глюкозния толеранс. Това състояние е предиабет и ако не се лекува навреме, то скоро ще доведе до развитието на тази тежка патология.

Номер на работата 1. КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ГЛЮКОЗАТА В КРЪВТА. ЕНЗИМАТИЧЕН (ГЛУКОСООКСИДЕН) МЕТОД

ОБОСНОВКА ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА РАБОТА. Определянето на глюкозата в цяла кръв или плазма се извършва при всеки пациент, за да се оцени състоянието на въглехидратния метаболизъм и да се диагностицира патология (хипергликемия, хипогликемия). За определяне на съдържанието на глюкоза в кръвта се използва ензимен метод, основан на окислението на глюкозата чрез глюкозна оксидаза до глюконова киселина в присъствието на кислород. Методът е много специфичен за определяне на D-глюкоза в присъствието на други редуциращи вещества, съдържащи се в тъканни екстракти и биологични течности.

ПРИНЦИП НА МЕТОДА. Глюкозооксидазата е комплексен ензим, съдържащ FAD като протетична група. Когато глюкозата се окислява с глюкозна оксидаза, два водородни атома се отделят от първия въглероден атом в глюкозната молекула. Освен това, тези два водородни атома се прехвърлят към FAD, FADH се образува₂. Последният прехвърля водородни атоми към молекулен кислород до H₂ох₂. Тогава H₂ох₂ той се разцепва от ензима пероксидаза във вода и атомния кислород, който окислява хромогена (багрилото), който се оцветява по време на окислението.

Метод на глюкозооксидазата

Днес най-широко се използват методи, основани на използването на ензима глюкоза оксидаза. Методът се основава на следната реакция:

Глюкозооксидазата катализира прехвърлянето на два водородни атома от първия въглероден атом на глюкоза към кислород, разтворен в течен реагент. В хода на реакцията се образува водороден пероксид в еквимоларни количества. Т.е. концентрацията на образувания водороден пероксид е точно равна на определената концентрация на глюкоза. Следователно, използването на глюкозооксидазната реакция трансформира проблема за определяне на концентрацията на глюкоза в проблема за определяне на концентрацията на водороден пероксид, който, както ще бъде показано по-долу, е много по-прост от първия. И тук има няколко метода, които днес са широко използвани в лабораторната практика (виж диаграмата).

Сред горепосочените методи за регистрация, най-широко използваният фотометричен биохимичен метод, при който молекулите на водородния пероксид под действието на ензима пероксидаза се разделят на образуването на активна кислородна форма - супероксиден анионен радикал - O₂ -, което от своя страна окислява хромогена, което води до значителна промяна в абсорбционния спектър на хромогена.

Високата популярност на този метод за определяне на глюкозата се дължи на неговата висока специфичност и лекота на прилагане. Методът може да бъде реализиран с използване на конвенционален фотометър, както и с използване на автоматични биохимични автоанализатори.

Глюкозооксидазният метод е признат днес като един от най-точните количествени методи за определяне на глюкозата. Като биологичен материал се използва като серум и цяла кръв. При работа с последното трябва да се вземе предвид фактът, че когато се взима капилярна кръв, делът на серума (плазма) зависи от стойността на хематокрита, което може да повлияе неблагоприятно на точността на резултата. Следователно, когато се определя глюкозата по описания по-горе метод, за предпочитане е да се използва серумът на пациента.

Наред с крайния фотометричен метод, преди няколко години, се появиха комплекти, в които се прилага кинетичен фотометричен метод. Същността на метода е, че при определено съотношение на активностите на глюкозна оксидаза и пероксидаза, скоростта на образуване на оцветено съединение за известно време след добавяне на пробата към работния разтвор ще бъде пропорционална на концентрацията на глюкоза в пробата. Предимството на този метод е, че резултатът не зависи от наличието на други съединения в пробата, тъй като абсорбцията на последната е стабилна във времето. Този метод изисква използването на кинетичен фотометър, полуавтоматични анализатори или автоматични биохимични анализатори. Измерването на концентрацията на глюкоза от цяла кръв се извършва удобно с инструменти, чиято работа се основава на амперометричния принцип на измерване, използвайки специални ензимни сензори. Водородният пероксид е изключително нестабилно химическо съединение и може да служи като източник на заредени частици. Това се използва в ензимните сензори от мембранния тип или в електрохимичните елементи на преносимите глюкометри.

В заключение трябва да споменем недостатъците на метода на глюкозооксидазата. Полученият водороден пероксид и супероксиден анионен радикал може да окислява не само хромогена, но и други вещества, присъстващи в биологичната течност: аскорбинова киселина, пикочна киселина, билирубин. В същото време съответно намалява делът на пероксида, който участва в окисляването на хромогена, което води до подценяване на резултатите от глюкозата. Този метод е линеен, като правило, до 20-30 mmol / l глюкоза.

Количествено определяне на кръвната захар чрез метода на глюкозооксидазата

Принципът на метода. Методът се основава на спецификата на действието на ензима глюкоза оксидаза. Този ензим окислява глюкозата в присъствието на молекулен кислород за образуване на глюконолактон, който спонтанно хидролизира до глюконова киселина. Глюкозната оксидаза окислява глюкозата до образуване на водороден пероксид (Н₂ох₂), който под действието на пероксидаза реагира с 4-аминоантипирин и фенол. Резултатът е розово оцветено съединение, чиято оптична плътност при 510 nm е пропорционална на концентрацията на глюкоза в пробата.

2 N₂ох₂ + 4-аминоантипирин + фенол → хинон имин + 4Н₂ох

оборудване: KFK, центрофуга, термостат, стативи, епруветки, пипети, биологичен материал, реактиви, съдържащи се в работния разтвор.

тестова проба, ml

стандартна проба, ml

еднократен тест (N₂О), ml

Калибриращ разтвор на глюкоза (стандарт)

Епруветките се инкубират в термостат при 37 ° С в продължение на 15 минути, след което се оцветяват със зелен филтър в зелен филтър в кювети с дебелина на слоя 5 mm срещу празна проба (Н).₂О). Розов цвят е стабилен за 1 час след инкубацията.

изчисление съдържание на глюкоза, получено по формулата:

C = x C стандарт, където

С е съдържанието на глюкоза в експерименталната проба, mol / l;

Eop е оптичната плътност на пробата;

Est е оптичната плътност на калибриращата проба;

С стандарт - съдържание в калибрационен разтвор, mol / l.

Нормални стойности:  новородени - 2.8-4.4 mmol / l

 деца - 3,9 -5,8 mmol / l

 възрастни - 3.9 - 6.2 mmol / l

Хипогликемия (HGH). Повишаването на кръвната глюкоза се дължи на много причини, според които има две групи хипергликемия.

1. Острално - свързано с недостатъчно съдържание на инсулин в организма или поради неефективност на действието му.

2. Екстраинсуларен (екстраинсуларен) - не зависи от ефекта на инсулина.

Следните процеси са най-важни при образуването на HGH: повишено разграждане на гликогена; повишена неоглукогенеза; инхибиране на синтеза на гликоген; намаляване на усвояването на глюкозата от тъканите под влияние на хормонални антагонисти на инсулин: соматотропин, глюкортикоиди, тироксин, тиротропин.

Алиментарната хипергликемия се наблюдава при прекомерна доставка на глюкоза в кръвта (например, хипергликемия при захарна натоварване). "Чернодробна" хипергликемия се среща при дифузни лезии на черния дроб.

Устойчивата и тежка хипергликемия най-често съпътства захарен диабет. Обичайно е да се изолира инсулин-зависим захарен диабет и неинсулинозависим захарен диабет, или съответно, захарен диабет тип I и захарен диабет тип II. Образуването на захарен диабет тип I се свързва предимно с нарушен синтез и обмен на инсулин.

Втората група хипергликемия се свързва предимно с хиперфункцията на ендокринните жлези, които произвеждат хормони - инсулинови антагонисти. Наблюдава се при такива заболявания като синдрома и болестта на Кушинг, акромегалия, тиреотоксикоза, феохромоцитом, глюкогенома. Нивата на кръвната захар също се повишават при някои чернодробни заболявания (по-специално при 10-30% от пациентите с цироза на черния дроб), хемохроматоза (пигментирана цироза на черния дроб, бронзов диабет).

Хипогликемия (HGP) - намаляване на кръвната захар - най-често се свързва с абсолютно или относително повишаване на нивата на инсулин в кръвта. Vnepankreaticheskim хипогликемия наблюдава в резултат на дисбаланс между степента на процесите на гликогенолизата и глюконеогенезата в черния дроб по време на остър и хроничен хепатит, цироза, остър и подостър чернодробно заболяване, алкохолна интоксикация, отравяне с арсен, фосфор, по време на продължителна механична жълтеница, конгестивна черния дроб, първичен или метастатичен рак на черния дроб, Намаляване на концентрацията на глюкоза в кръвта често се наблюдава при пациенти, страдащи от рак на хранопровода и други злокачествени тумори с екстрапанкреатична локализация (фиброма, фибросарком, неврома), както и непоправима повръщане, анорексия, чернодробен диабет, уремия, обилна лактация и глюкозурия при бременни жени.

Хипогликемията може да бъде от централен произход поради психична травма, енцефалит, субарахноидален кръвоизлив, мозъчен тумор.

1. Наследствени нарушения на храносмилането с въглехидрати.

2. Какви типове хиперглюкоза са ти известни?

3. Какви са причините за патологичната хиперглюкоземия?

4. Каква е причината за инсулин-зависимия захарен диабет?

5. Какви са биохимичните причини за наследствени заболявания: а) гликогеноза? б) агликогеноза? в) фруктоземия? г) галактоземия?

6. Какви са биохимичните промени в метаболизма на въглехидратите по време на гладно?

7. Принципът на метода за определяне на глюкозния толеранс.

Глюкозооксидазна и хексокиназа методи за определяне на серумната глюкоза в кръвта

Точната диагноза, предписването на лечение изисква серия от лабораторни тестове.

Методът за определяне на серумната глюкоза е най-важният инструмент за откриване на хипер- и хипогликемия при пациенти със захарен диабет.

Методът позволява да се коригират метаболитни нарушения на данните от медицинската терапия. Диагностичните нива на глюкозата могат също да бъдат определени в цяла кръв и нейната плазма.

Методи за определяне на кръвна захар

Методите за определяне на количеството глюкоза в кръвта се развиват много.

Някои от тях (редукциониометрични, колориметрични) практически не се използват поради високата токсичност и ниската точност на резултатите.

Най-често използваните ензимни изследвания. Методът на глюкозооксидазата е метод за цветна реакция, който се появява при нагряване на въглехидрати. Хексокиназата определя активността на кръвта върху хексокиназата.

Метод на глюкозооксидазата

Глюкозооксидазният метод за определяне на кръвна захар се основава на неговата окислителна реакция под влиянието на ензим. Това образува водороден пероксид, оцветява веществото Хромоген, чиято концентрация определя количеството глюкоза.

Глюкозооксидазният метод се използва за:

наследствена непоносимост към фруктоза;
pentosuria;
непоносимост към лактулоза.

Недостатъкът на проучването е, че водороден пероксид е способен да окисли както присъстващите в кръвта хромоген, така и аскорбинова, пикочна киселина и билирубин. Изчислява се количеството на глюкозния фотометричен метод, интензивността на оцветяването се сравнява с калибрационната графика.

В лабораторни условия може да се определи нивото на веществото:

в венозна кръв. Използват се автоматични анализатори;
в капилярна кръв. Оградата се извършва от пръст.

Електрохимичният метод се състои в използване на електроди, съдържащи глюкозна оксидаза. Определя се количеството на генерирания водороден пероксид или оставащото количество кислород, консумирано по време на окислителния процес.

Метод на хексокиназа

Веществото е най-важният ензим на глюкозния метаболизъм, който ограничава скоростта на процеса в клетките.

В лабораторни условия, под действието на хексокиназа, глюкозата се фосфорилира от аденозин трифосфат.

В резултат на реакцията се образуват органични молекули, количеството на които се определя от нивото на абсорбция на светлина в ултравиолетовата зона. Твърде бързо положителната реакция на хексокиназата може също да е признак за поява на злокачествени тумори.

Подготовка за анализ

Тест за глюкоза в кръвния серум е предписан за:

Преди анализ, трябва да следвате редица условия, така че резултатите да бъдат възможно най-надеждни:

изследванията се извършват на празен стомах. Материали, взети сутрин;
няколко дни преди поставянето на диагнозата е необходимо да се избягват тежки физически натоварвания, стрес;
В ежедневната диета на пациента трябва да има най-малко 150 грама въглехидрати. При дефицит нивото на глюкоза ще се увеличи и ще падне бавно, което нарушава анализа на данните;
в деня преди диагнозата не може да пуши и пие алкохолни напитки;
Невъзможно е да се проведе проучване след тежки операции, раждане, при наличие на възпаление. Противопоказано при анализ на чернодробна цироза, обостряне на заболявания на стомаха, туморни процеси;
Няколко дни преди изследването не трябва да се подлагат на физиотерапевтични процедури, да се приемат орални контрацептиви, диуретични лекарства, психотропни лекарства, кофеин.

Анализът може да даде фалшиво положителен резултат при хипокалиемия и ендокринни заболявания (синдром на Кушинг, тиреотоксикоза).

Норми на глюкоза в кръвния серум по възраст

Нормалните показатели зависят от възрастта:

кръвта от пъпната връв може да съдържа от 2,5 до 5,3 mmol / l;
при недоносени бебета - от 1,1 до 3 mmol / l;
деца от първия ден на живота - от 2.22 до 3.33;
на възраст от 2,7 до 4,4;
при деца над 6 години - от 3.3 до 5.5 mmol / l;
при възрастни до 60 години - от 4.4 до 6.3;
при възрастни - от 4.6 до 6.1 mmol / l.

Хипогликемия при възрастни е диагностицирана с глюкозни стойности по-малки от 3.3 mmol / l, а хипергликемията - повече от 6.1 mmol / l.

Метод на глюкозоксидаза за определяне на глюкоза в плазмата

Радваме се да Ви посрещнем на сайта www.unimedao.ru!

Благодаря ви, че отговорихте на нашия въпрос.

19.11.2009

Герасименко В.А., д-р Куриляк О.А.

От архива на вестник "Новини А / О Унимед"

Определянето на концентрацията на глюкоза в кръвта е едно от най-често провежданите биохимични изследвания в QDL. Причината за изключителната популярност на теста е свързана с висока честота на диабет. Този тест се провежда както в стационарни, така и в амбулаторни клиники. Пациентите с диабет са принудени да изследват нивото на глюкоза в кръвта у дома, защото без тази информация им е трудно да коригират диетата си, упражненията, употребата на инсулин и други антидиабетни лекарства. Изключителната важност на теста и големите обеми на проведените изследвания стимулираха разработчиците да създадат различни видове устройства и методи за определяне на концентрацията на глюкоза в кръвта.

Понастоящем има много методи за определяне на глюкозата. Те могат да бъдат класифицирани както следва.

Методи за определяне на глюкоза в серум

- фотометрична крайна точка

- отразяваща фотометрия - суха химия

Първите два метода са изключително неудобни, токсични и имат ниска точност, така че няма да се спираме върху тях.

Метод на глюкозооксидазата

На фиг. Фигури 1 и 2 показват спектрите на работния разтвор преди и след добавяне на стандартния разтвор на глюкоза. Максималната абсорбция на реакционната смес - (реактив + глюкоза) е в областта на 500 nm. Съответно, промяната в оптичната плътност на крайната реакция при дължина на вълната 480-520 nm е пропорционална на концентрацията на глюкоза, съдържаща се в пробата.

Високата популярност на този метод за определяне на глюкозата се дължи на неговата висока специфичност и лекота на прилагане. Методът може да бъде реализиран с помощта на конвенционален фотометър (по-добре от специализиран биохимичен фотометър като Mikrolab 540) или с помощта на автоматични биохимични автоанализатори.

Наред с крайния фотометричен метод, преди няколко години, се появиха комплекти, в които се прилага кинетичен фотометричен метод. Същността на метода е, че при определено съотношение на активностите на глюкозна оксидаза и пероксидаза, скоростта на образуване на оцветено съединение за известно време след добавяне на пробата към работния разтвор ще бъде пропорционална на концентрацията на глюкоза в пробата. Предимството на този метод е, че резултатът не зависи от наличието на други съединения в пробата, тъй като абсорбцията на последната е стабилна във времето. Този метод изисква използването на кинетичен фотометър, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматични анализатори, такива като Clima 15, или автоматични биохимични анализатори. Измерването на концентрацията на глюкоза от цяла кръв се извършва удобно с инструменти, чиято работа се основава на амперометричния принцип на измерване, използвайки специални ензимни сензори. Водородният пероксид е изключително нестабилно химично съединение и може да служи като източник на заредени частици. Това се използва в ензимните сензори от мембранния тип или в електрохимичните елементи на преносимите глюкометри.

Проба от цяла кръв (обикновено 20 µl) се разрежда в системен буферен разтвор (червените кръвни клетки се унищожават) и след това се подават през линия в поточна клетка. Глюкоза, подложена на окисление под въздействието на ензима глюкоза оксидаза, разположен на мембраната. Полученият водороден пероксид дифундира през мембраната и се окислява допълнително в каталитичната реакция под действието на платина. Дифузията на водороден пероксид на повърхността на платината образува ток, пропорционален на броя на молекулите Н₂ох₂. Така полученият сигнал се обработва от устройството при съответната стойност на напрежението. Тази измерена стойност е пропорционална на концентрацията на глюкоза в пробата.

Като пример за инструменти, използващи описания по-горе метод, можем да споменем анализаторите на глюкоза Biosen (Германия). Тези устройства са удобни за употреба не само в болници, но и в поликлиники, където тестването на глюкозата се извършва главно от капилярна кръв.

Важна стъпка в развитието на клинични лабораторни диагностични методи е появата на "суха химия". Естествено, една от първите приложения на тази технология беше задачата за определяне на глюкозата в кръвта на пациента. Първите устройства бяха значително по-ниски по отношение на точността на традиционните лабораторни методи за изследване. С течение на времето обаче редица фирми успяха да разработят такива диагностични ленти и отразяващи фотометри, които осигуряват много висока точност на анализа. Глюкометрите с едно докосване и тест лентите Life Scan (САЩ) са широко разпространени по целия свят и успешно съчетават аналитичната точност на количествения ензимен метод със скоростта и простотата на „сухата химия“.

Глюкометрите за кръвна захар на One Touch са предназначени за бързо и точно измерване на нивата на глюкоза в цялата кръв. Тест лентата One Touch съдържа всички необходими химични компоненти за двустепенния метод на глюкозооксидаза, включително ензимите глюкоза оксидаза и пероксидаза, които се адсорбират върху уникална пореста хидрофилна мембрана. Резултатът от реакцията е образуването на оцветен комплекс. Интензивността на разработения цвят се записва с отражателен минифотометър.

Мембранната тест лента One Touch наподобява гъба с микроскопични пори и изпълнява тройна функция. Действа: 1) като резервоар, събиране на необходимото количество кръв, 2) като филтър, блокиране на твърд клетъчен материал (еритроцити, левкоцити и др.), 3) като гладка оптична повърхност, върху която се измерва отразената светлина. Последната функция, по-специално, е много важна за работата на устройството. Той дава възможност да се прочете долната част на лентата, докато кръвта остава в горната част на тест лентата. Следователно, не е необходимо да се измива (попива) кръвта от повърхността на тест лентата.

В допълнение, мембраната има хидрофилни свойства, поради което капка кръв "привлича" към повърхността на тест лентата, когато се докосне.

Устройството One Touch включва два специални светодиода. Обработката на разработения цвят върху тест лентата е както следва. Веднага след като тестовата лента е поставена в устройството, се получава нулево отчитане. В този момент на дисплея виждаме: “WAIT”. Когато на тест-лентата се поставя капка кръв, кръвната плазма незабавно се сорбира от мембраната, докато еритроцитите и излишната плазма остават на повърхността на мембраната. След пълното поглъщане на капка кръв се появява незабавно оцветяване. Устройството записва промяната на величината на отражението и автоматично стартира таймера. След 45 секунди химическата реакция завършва, резултатът от отражението на светлината се обработва. Цветният реакционен продукт поглъща светлината, излъчвана от първия светодиод. Кръвните клетки и излишната плазма също поглъщат светлината, излъчвана от диода. За да се коригира отражението на фона, второто отчитане се извършва от втори светодиод при различна дължина на вълната. Разликата между сигналите от първия и втория светодиоди носи информация за абсорбцията на светлината от хромогена. Сигналът, получен от хромогена за оценка на концентрацията на глюкоза, е свързан със специално калибриране. Всички устройства с едно докосване са калибрирани чрез референтния метод на лабораторен анализатор на глюкоза. При тази процедура се получава стандартна калибровъчна крива. Трябва да се отбележи, че е доста трудно да се установи производството на тест ленти, които биха били абсолютно същите химически, поради много ниската концентрация на реактивите. За решаването на този проблем се използва стандартна калибровъчна крива, състояща се от 16 калибрационни линии. Контролът на качеството се извършва непосредствено след производството на тест-ленти, което позволява да се определи кои от калибрационните линии (от 1 до 16) могат да се прилагат към тази тест-лента. Това е така нареченият кодов номер, който се поставя върху опаковката на тест лентите. Тези 16 линии за калибриране също са програмирани в микропроцесора на инструмента. За да получите оптимално точни резултати, кодовия номер, посочен върху опаковката на тест лентите, се задава в устройството с помощта на кодовия бутон. По този начин неправилно инсталиран код на инструмента може да причини грешка в измерването.

След появата на устройствата One Touch на пазара, в лабораториите на Русия, Америка и Европа са преминали голям брой клинични изследвания. Едно от тези изследвания е проведено от Ендокринологичния научен център на Руската академия на медицинските науки по искане на Руската асоциация за медицинска лабораторна диагностика. Специалистите от Центъра проведоха сравнителен анализ на два метода за измерване на нивата на кръвната захар. Резултатите, получени на One Touch, бяха сравнени с данните, получени от биохимичния анализатор Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), който прилага хексокиназния метод за определяне на глюкоза. Изследвани са 190 кръвни проби от 95 пациенти. Коефициентът на корелация на резултатите е 0.98641. Коефициентът на вариация в нормалния и патологичния диапазон на измервателния уред One Touch не надвишава 2,5%.

В официалния доклад на Центъра за ендокринологични изследвания към Руската академия на медицинските науки се казва: “Устройствата с едно докосване имат висока точност и точност, както и широк спектър от измервания. Те могат да бъдат използвани за диагностициране на аварийни състояния при диабет, включително аварийни екипи, защото тези устройства са не само надеждни, но и бързо дават резултати. "

Метод на хексокиназа

Регистрацията се извършва при дължина на вълната 340 nm при абсорбцията на NADH. Този метод е много специфичен и не реагира с други компоненти на кръвния серум. Методът на хексокиназата се счита за референция за определяне на глюкозата. По правило тя е линейна до 50 mmol / l, което позволява да бъде широко препоръчвано за клиники с ендокринологични отделения.

От описаното разнообразие от методи за определяне на глюкоза, служителите на QDL могат сами да решат кой метод на определяне и кое устройство да изберат:

Методите за "мокра" биохимия, внедрени на автоматични биохимични анализатори, ще осигурят нуждите на лабораториите с голям поток от анализи.
Анализаторите на глюкоза тип Biosen изискват минимални усилия от страна на оператора, тъй като те са напълно автоматизирани и достатъчно продуктивни (скорост от 50 до 200 проби на час).
За лаборатории с малък брой проучвания, както и експресни лаборатории, специализиран биохимичен фотометър Mikrolab 540 е удобен.
За помощни екипи, скрий помощ е идеалното решение - глюкомери за кръвта като One Touch.

По този начин, задачата на QDL да осигури не само бързо, но и много точно определяне на глюкозата, е напълно разрешима днес.

Кръвна захар, урина, алкохол

Кръвната захар е строго контролирана.

Контролът на концентрацията на глюкоза в кръвта се извършва от нервни влияния и хормони.

Нервна регулация

Нервната регулация на концентрацията на глюкоза в кръвта се изразява в положителния ефект на n.vagus върху инсулиновата секреция и инхибиращия ефект върху този процес на симпатиковата инервация. В допълнение, освобождаването на адреналин в кръвта е обект на симпатични влияния.

Хормонално регулиране

Основните хормонални регулаторни фактори са глюкагон, адреналин, глюкокортикоиди, соматотропен хормон от една страна и инсулин от друга. Всички хормони, с изключение на инсулин, засягащи черния дроб, повишават гликемията.

Инсулинът е единственият хормон в организма, който има за цел да понижи нивата на кръвната захар. С неговото влияние, глюкозата се абсорбира силно от мускулите и мастната тъкан.

Намаляването на концентрацията на глюкоза в кръвта чрез инсулин се постига по следните начини:

прехода на глюкоза в клетките - активиране на GluT 4 транспортерни протеини върху цитоплазмената мембрана,
включване на глюкоза в гликолизата - увеличаване на синтеза на глюкокиназа, ензим, наречен глюкозен капан, стимулиране на синтеза на други ключови гликолизни ензими - фосфофруктокраназа, пируват киназа,
повишен синтез на гликоген - активиране на гликоген синтазата и стимулиране на нейния синтез, което улеснява превръщането на излишната глюкоза в гликоген,
активиране на пентозофосфатния път - индуциране на синтеза на глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа и 6-фосфоглюконат дехидрогеназа,
повишена липогенеза - участието на глюкоза в синтеза на триацилглицероли или фосфолипиди.

Много тъкани са напълно нечувствителни към действието на инсулина, те се наричат инсулин-независими. Те включват нервна тъкан, стъкловидно тяло, леща, ретина, гломерулни бъбречни клетки, ендотелни клетки, тестиси и червени кръвни клетки.

Глюкагонът повишава кръвната захар:

повишаване на мобилизацията на гликоген чрез активиране на гликоген фосфорилаза,
стимулиране на глюконеогенезата - увеличаване на работата на ензимите пируват карбоксилаза, фосфоенолпируват карбоксикиназа, фруктоза-1,6-дифосфатаза.

Адреналинът причинява хипергликемия:

активиране на мобилизацията на гликоген - стимулиране на гликоген фосфорилаза,

Глюкокортикоидите повишават кръвната захар

чрез потискане на прехода на глюкоза в клетката,
стимулиране на глюконеогенезата - повишаване на синтеза на ензими пируват карбоксилаза, фосфоенолпируват карбоксикиназа, фруктоза-1,6-дифосфатаза.

Таблицата обобщава основните аспекти на хормоналните влияния:

Активиране на гликогенолиза в черния дроб;
Стимулиране на глюконеогенезата;

Повишена глюконеогенеза;
Намалена мембранна пропускливост на глюкоза.

Кръвна захар в клиничната практика

Над 90% от всички разтворими нискомолекулни кръвни въглехидрати са глюкоза; в допълнение, фруктоза, малтоза, маноза и пентоза могат да присъстват в малки количества, а в случай на патология, галактоза. Заедно с тях в кръвта има полизахариди, свързани с протеини.

Особено интензивно се консумират глюкозата и се използват за различни нужди на тъканта на централната нервна система, червените кръвни клетки, мозъчната тъкан на бъбреците. В междинния метаболизъм глюкозата се използва за образуване на гликоген, глицерол и мастни киселини, аминокиселини, глюкуронова киселина и гликопротеини. Концентрацията на глюкоза в кръвта е производно на гликолиза и окисление на трикарбоксилни киселини в ТСА цикъла, гликогенеза и гликогенолиза в черния дроб и мускулната тъкан, глюконеогенеза в черния дроб и бъбреците и глюкозен прием от червата.

В клиничната практика обикновено се изследват нивата на кръвната захар, концентрацията на други захари и гликоген се използва много по-рядко. В човешката кръв глюкозата е сравнително равномерно разпределена между плазмата и образуваните елементи, установено е, че съдържанието на захар във венозната кръв е 0.25-1.0 mmol / l (средно с 10%) по-малко, отколкото в артериалната и капилярната кръв. Дефиницията на млечна и пировинова киселина, активността на редица ензими на въглехидратния метаболизъм, сиалова и хексуронова киселини, серомукоиди, гликозилиран хемоглобин и други показатели е с известна диагностична стойност.

Съдържанието на глюкоза в урината зависи от концентрацията му в кръвта, въпреки че се екскретира в нормални и повишени нива на кръвната захар. С повишаване на концентрацията на глюкоза в кръвта се преодолява т.нар. Бъбречен праг (при здрави хора той се намира в областта 8,3–9,9 mmol / l) и се появява глюкозурия. При артериосклеротичен бъбрек, при диабет, повишаването на прага и глюкозурията не могат да бъдат забелязани дори при повишаване на концентрацията на глюкоза до 11.0-12.1 mmol / l.

Методи за определяне на кръвна захар

Методите за определяне на кръвната глюкоза се разделят на три групи: редукционни, колориметрични и ензимни.

Методи за намаляване (Трябва да се има предвид, че методите на тази група дават надценени резултати (с около 20-25%), тъй като кръвта съдържа редица съединения, които не са свързани с въглехидрати, но имат редуциращи свойства (пикочна киселина, глутатион, креатинин, аскорбинова). киселина)):
- Титрометричният метод на Хагедорн-Йенсен се основава на свойствата на захарта да се възстанови, когато се кипи в алкална среда, калиеви соли на желязо и синус и желязо-сулидинат. Според степента на това възстановяване, концентрацията на захар в кръвта се изследва чрез титрометрия. Важно предимство на метода е неговата ниска цена и възможност за използване във всяка лаборатория;
- на базата на редукция на нитробензени, например, пикринова киселина до пикраминова киселина;
- Метод, основан на способността на глюкозата да редуцира медни соли. Получената едновалентна мед действа като междинно съединение. Окислена от кислород от въздуха, тя възстановява арсено-молибдената киселина или фосфорната волфрамова киселина, които служат като краен хромоген.
Колориметрични методи. Те включват:
- Метод Somodzhi - реакция на редукция на медта, която е в състава на медно-ортронния реагент, към меден оксид. Методът е труден, многостепенен, неспецифичен и практически не се използва в момента;
- Метод Фолин-Ву - редукция на меден тартарат до литиев оксид. Методът е прост, а недостатък е липсата на строга пропорционалност между интензитета на получения цвят и концентрацията на глюкоза;
- определяне на концентрацията на глюкоза според Morris и Roe - дехидратация на глюкоза под действието на сярна киселина и нейното превръщане в оксиметилфурфурол, който кондензира с артрон в синьо съединение. Изисква най-чистите реагенти и стриктното спазване на постоянната температура на реакцията;
- Ортотолуидиновият метод на Gultman в модификацията на Khivarinen-Nikkil, който се състои в определяне на интензивността на оцветяването на разтвора, което се получава, когато ароматният амин ортотолуидин взаимодейства с алдехидната група на глюкозата в кисела среда. Този метод е точен и позволява по-специфично определяне на глюкозата.
- Методът на анилин запазва чувствителността на ортотолуидиновия метод, но е още по-специфичен.
Ензимни методи:
- на базата на хексокиназната реакция. Глюкозата под действието на хексокиназа се фосфорилира от АТР, полученият Gl-6-F в присъствието на дехидрогеназа възстановява NADP. Количеството на последното се определя от увеличаването на абсорбцията на светлина в ултравиолетовата област. Методът е твърде скъп за практически лаборатории.
- на базата на окислението на глюкоза до глюкуронова киселина, използвайки ензима глюкоза оксидаза и образуването по време на реакцията на водороден пероксид, който (в различни версии):
  - определят се по химичен път;
  - с участието на пероксидаза, той окислява безцветния ортотолидин, превръщайки го в зелено-синьо оцветено съединение, праволинейността на цветната зависимост от концентрацията на глюкоза остава в интервала от 1.1 до 22 mmol / l;
  - в присъствието на фенол с участието на пероксидаза, окислява 4-аминоантипирин до оцветено в оцветител съединение;
  - в присъствието на медни йони, той окислява фенолфталин до фенолфталеин, който е оцветен в червено при алкални условия.
Електрохимични методи, които използват електроди, съдържащи имобилизирани ензими, по-специално глюкозна оксидаза. Реакцията се записва от количеството образуван водороден пероксид или от загубата на кислород, консумиран за окислението на глюкоза.
Диагностични ленти, използващи глюкозоксидаза-пероксидазната реакция и бензидинови производни като хромоген.

Приети са три метода като унифицирани: титрометричния метод Хагедхорн-Йенсен, орто-толуидиновия метод и о-толидин глюкозооксидазния метод.

Определяне на глюкозата по метода на ортотолуидин

принцип

Глюкоза при нагряване с ортотолуд в присъствието на сярна киселина дава синьо-зелен цвят.