Технология на производството на инсулин

  • Предотвратяване

Инсулинът е един от хормоните, произвеждани от самия човешки организъм, по-специално от панкреаса. Нарушаването на секрецията на това вещество води до появата на такова сериозно заболяване като диабет. За лечението му използва синтетичен хормон, който дълго време е изолиран от панкреаса на добитъка. Въпреки това, технологията за производство на инсулин с помощта на много често срещана бактерия - Escherichia coli или гъбичка от дрожди се използва от доста време. Използването на този метод ви позволява да избегнете алергични реакции, причинени от чужд протеин, който има малка разлика от човека.

Технологична схема

Технологията на производство на инсулин включва всички основни етапи на производството на биотехнологични продукти. Резултатът е кристален краен продукт, който след това се използва за приготвяне на инжекционни разтвори, използвани при лечението на тежък захарен диабет тип I и II. Основният ефект на този хормон в организма се проявява в намаляване на съдържанието на глюкоза в кръвта.

Етапите на производство на инсулин ще бъдат както следва:

  • Предварителен. Извършва операции като подготовка и пречистване на вода и въздух, почистване на производствени помещения и стерилизация на оборудване, проверка на персонала, обработка на ръцете и издаване на стерилни обувки и облекло. Също така на предварителния етап се извършва първичен химичен синтез на молекулярните вериги, от които се сглобява протеинът. Верига А съдържа 21 аминокиселинни остатъци, а верига В съдържа 30 аминокиселини.
  • Приготвяне на хранителни разтвори и клетъчна култура. За да накара живата клетка да произведе необходимото съединение, се въвежда съответният ген. За целта плазмидът се отрязва от специални ензими, рестриктази и в него се ушиват гените, кодиращи синтеза на необходимите съединения. След това, като се използва метод за микроинжекция, модифицираният плазмид се връща в клетката.
  • Култивиране на клетъчна суспензия. Генетично модифицираните клетки се поставят в хранителен разтвор, съдържащ всички съставки, необходими за растеж и размножаване и подложени на стерилизация. Отглеждането на културата се извършва в специални биореактори, където се подава предварително пречистеният въздух. Периодично в реактора се добавя известно количество хранителен разтвор и в същото време се отнема същият обем клетъчна суспензия.
  • Разпределението на културата. Разделянето на флуидната и клетъчната култура се извършва чрез утаяване (утаяване) в специални седиментатори и след това филтриране, което позволява да се запази целостта на клетките.
  • Хроматографско пречистване на веществото. Извършва се върху подходящо оборудване, като се използват различни методи, по-специално фронтална, анионообменна и гелпроникваща хроматография.
  • Получаване на протеинова молекула. На същинския биотехнологичен етап настъпва синтез на непроизведена инсулинова молекула. И двата компонента на неговите вериги. Те се зашиват след окисляване и нагъване на получените вериги, което води до образуването на дисулфидни мостове.
  • Сушене чрез замразяване в специална пещ, след което полученият кристален препарат се проверява за съответствие със стандарта, опакован, етикетиран и изпратен на потребителя.

Нашата компания при благоприятни условия предлага готови производствени линии, в които напълно се спазва цялата технология на производство на инсулин. Благодарение на точните изчисления, техническата и информационната поддръжка, както и обучението на персонала в рамките на цялостна програма, компанията ще бъде печеливша и нейните продукти ще бъдат търсени.

Видове инсулин и методи за неговото производство

1. Видове инсулин

2. Получаване на инсулин

Инсулин (от латински. Insula - остров) е пептиден хормон, който се образува в бета клетките на панкреатичните острови на Лангерханс. Той има многостранен ефект върху метаболизма в почти всички тъкани.

Основната функция на инсулина е да осигури пропускливостта на клетъчните мембрани за глюкозните молекули. В опростена форма можем да кажем, че не само въглехидратите, но и всички хранителни вещества се разделят на глюкоза, която се използва за синтезиране на други молекули, съдържащи въглерод, и е единственият вид гориво за клетъчните електроцентрали - митохондрии. Без инсулин пропускливостта на клетъчната мембрана до глюкоза пада 20 пъти, а клетките умират от глад и излишната захар, разтворена в кръвта, отрови тялото.

Увреждането на секрецията на инсулин, дължащо се на деструкцията на бета-клетките - абсолютен инсулинов дефицит - е ключов елемент в патогенезата на захарен диабет тип 1. Нарушаването на ефекта на инсулина върху тъканта - относително дефицит на инсулин - има важно място в развитието на диабет тип 2.

Историята на откриването на инсулин е свързана с името на руския лекар И.М. Соболев (втората половина на 19-ти век), който доказа, че нивото на захар в човешката кръв се регулира от специален хормон на панкреаса.

През 1922 г. инсулин, изолиран от панкреаса на животно, е представен за първи път на десетгодишно диабетично момче. резултатът надмина всички очаквания, а година по-късно американската фирма Eli Lilly пусна първия животински инсулинов препарат.

След получаването на първата индустриална партида инсулин през следващите няколко години се пресича огромен начин за неговото изолиране и пречистване. В резултат на това хормонът стана достъпен за пациенти с диабет тип 1.

През 1935 г. датският изследовател Hagedorn оптимизира действието на инсулина в организма, като предлага продължително лечение.

Първите инсулинови кристали са получени през 1952 г., а през 1954 г. английският биохимик Г.Сенгер дешифрира структурата на инсулина. Разработването на методи за пречистване на хормона от други хормонални вещества и продукти на инсулинова деградация направи възможно получаването на хомогенен инсулин, наречен еднокомпонентен инсулин.

В началото на 70-те години Gg. Съветски учени А. Yudaev и S. Shvachkin предложи химически синтез на инсулин, обаче, прилагането на този синтез в промишлен мащаб е скъпо и нерентабилно.

В бъдеще се наблюдава прогресивно подобряване на степента на пречистване на инсулините, което намалява проблемите, причинени от инсулинови алергии, нарушена бъбречна функция, зрително увреждане и имунна инсулинова резистентност. Най-ефективният хормон е необходим за заместителна терапия при захарен диабет - хомоложен инсулин, т.е. човешки инсулин.

През 80-те години напредъкът в молекулярната биология дава възможност да се синтезират и двете човешки инсулинови вериги, използващи E.coli, които след това са свързани в биологично активна хормонална молекула, а рекомбинантният инсулин е получен в Института по биоорганична химия на Руската академия на науките, използвайки генетично инженерни щамове E.coli.

Използването на афинитетна хроматография значително намалява съдържанието на замърсяващи протеини в препарата с по-високо молекулно тегло от инсулина. Такива протеини включват проинсулин и частично разцепени проинсулини, които са способни да индуцират производството на антиинсулин антитела.

Употребата на човешки инсулин от самото начало на терапията намалява до минимум появата на алергични реакции. Човешкият инсулин се абсорбира по-бързо и, независимо от формата на лекарството, има по-кратка продължителност на действие от животинския инсулин. Човешките инсулини са по-малко имуногени от свинското, особено смесените говежди и свински инсулини.

1. Видове инсулин

Инсулиновите препарати се различават по степен на пречистване; източник на получаване (говеда, свине, хора); вещества, добавени към инсулиновия разтвор (удължаване на действието му, бактериостатици и др.); концентрация; рН стойност; възможността за смесване на ICD с SDI.

Инсулиновите препарати варират в зависимост от източника. Свинският и говежди инсулин се различават от човешки по аминокиселинен състав: говежди в три аминокиселини и свински в един. Не е изненадващо, че при лечението с говежди инсулин нежеланите реакции се развиват много по-често, отколкото при лечение с свински или човешки инсулин. Тези реакции се изразяват в имунологична инсулинова резистентност, инсулинова алергия, липодистрофия (промяна в подкожната мастна тъкан на мястото на инжектиране).

Въпреки очевидните недостатъци на говежди инсулин, той все още се използва широко в света. И все пак, имунологично, недостатъците на говежди инсулин са очевидни: в никакъв случай не се препоръчва да се предписва за пациенти с ново диагностициран захарен диабет, бременни жени или за краткотрайна инсулинова терапия, например, в периоперативния период. Отрицателните качества на говеждия инсулин също се запазват, когато се използват в смес с свински, така че смесените (свински + говежди) инсулини също не трябва да се използват за лечение на тези категории пациенти.

Препаратите за човешки инсулин за химична структура са напълно идентични с човешкия инсулин.

Основният проблем на биосинтетичния метод за получаване на човешки инсулин е пълното пречистване на крайния продукт от най-малките примеси на използваните микроорганизми и техните метаболитни продукти. Новите методи за контрол на качеството гарантират, че човешките биосинтетични инсулини на горепосочените производители не съдържат никакви вредни примеси; по този начин степента им на пречистване и ефективност на понижаване на глюкозата отговарят на най-високите изисквания и са почти еднакви. Всякакви нежелани странични ефекти, в зависимост от примесите, тези лекарства нямат инсулин.

В момента в медицинската практика се използват три вида инсулини:

- къси разстояния с бързо начало на ефекта;

- средна продължителност на действието;

- дълго действа с бавен ефект.

Таблица 1. Характеристики на търговските инсулинови препарати

Късодействащият инсулин (ICD) - обикновен инсулин - е краткодействащ кристален цинков инсулин, който е разтворим при неутрално рН, ефектът от който се развива в рамките на 15 минути след подкожно приложение и продължава 5-7 часа.

Първият удължен инсулин (SDI) е създаден в края на 30-те години, така че пациентите могат да правят инжекции по-рядко, отколкото при самостоятелно използване на ICD, ако е възможно веднъж дневно. За да се увеличи продължителността на действие, всички други инсулинови препарати се модифицират и, когато се разтворят в неутрална среда, образуват суспензия. Те съдържат протамин в фосфатен буфер - протамин цинк-инсулин и NPH (неутрален протамин Hagedorn) - NPH-инсулин или различни концентрации на цинк в ацетатен буфер - инсулин ултраленте, лента, седемдесет.

Средно продължителни инсулинови препарати съдържат протамин, който е протеин със средна стойност m. 4400, богати на аргинин и получени от дъгова пъстърва. За образуването на комплекса се изисква съотношение на протамин и инсулин 1:10. след подкожно приложение, протеолитичните ензими разрушават протамин, позволявайки инсулинът да се абсорбира.

NPH-инсулин не променя фармакокинетичния профил на смесения с него регулаторен инсулин. NPH-инсулин е за предпочитане пред инсулинова лента като компонент на средната продължителност на действие в терапевтични смеси, съдържащи обикновен инсулин.

Във фосфатния буфер всички инсулини лесно образуват кристали с цинк, но само говежди инсулинови кристали са достатъчно хидрофобни, за да осигурят бавно и стабилно освобождаване на инсулин, характерен за ултраленте. Цинкови кристали на свински инсулин се разтварят по-бързо, ефектът идва по-рано, продължителността на действие е по-кратка. Следователно, няма лекарство ултраленте, съдържащо само свински инсулин. Монокомпонентният свински инсулин се произвежда под името инсулинова суспензия, инсулин неутрален, инсулин изофан, инсулинов аминоаминид.

Инсулиновата лента представлява смес от 30% инсулин от полуглавата (аморфна инсулинова утайка с цинкови йони в ацетатен буфер, ефектът от която се разсейва сравнително бързо) със 70% инсулин ултраленте (слабо разтворим кристален инсулин, който има забавено начало и удължено действие). Тези два компонента осигуряват комбинация с относително бързо абсорбиране и стабилно дълготрайно действие, което прави инсулиновата лента удобен терапевтичен агент.

2. Получаване на инсулин

Човешкият инсулин може да се произвежда по четири начина:

1) пълен химически синтез;

2) извличане от панкреаса на човек (и двата метода не са подходящи поради неефективност: недостатъчно развитие на първия метод и липса на суровини за масово производство по втория метод);

3) чрез полусинтетичен метод, използващ ензимно-химично заместване в позиция 30 на В-веригата на аминокиселината аланин в свински инсулин с треонин;

4) биосинтетичен метод за генно инженерство. Последните два метода позволяват да се получи човешки инсулин с висока чистота.

Понастоящем човешкият инсулин се получава главно по два начина: чрез модифициране на свинския инсулин чрез синтетичен ензимен метод и чрез метод на генно инженерство.

Инсулинът е първият протеин, получен за търговски цели, използвайки рекомбинантна ДНК технология. Съществуват два основни подхода за получаване на генетично модифициран човешки инсулин.

В първия случай отделните (различни продуктови щамове) произвеждат и двете вериги, последвани от сгъване на молекулата (образуване на дисулфидни мостове) и разделяне на изоформи.

Във втория препарат под формата на прекурсор (проинсулин), последван от ензимно разделяне с трипсин и карбоксипептидаза В до активната форма на хормона. Най-предпочитано в момента е получаването на инсулин като прекурсор, осигуряващ правилното затваряне на дисулфидните мостове (в случай на отделно производство на вериги, се провеждат последователни цикли на денатуриране, разделяне на изоформи и ренатурация).

В двата подхода е възможно както индивидуално да се получат изходните компоненти (А и В вериги, или проинсулин), и като част от хибридните протеини. В допълнение към А- и В-веригите или проинсулина, може да присъства в състава на хибридните протеини:

- протеинов носител, осигуряващ транспортиране на хибридния протеин в периплазменото пространство на клетката или културалната среда;

- компонент на афинитет, значително улесняващ селекцията на хибриден протеин.

В същото време и двата компонента могат да присъстват едновременно в състава на хибридния протеин. В допълнение, при създаването на хибридни протеини може да се използва принципът на многомерност (т.е. няколко копия на целевия полипептид присъстват в хибридния протеин), което прави възможно значително да се увеличи добива на целевия продукт.

Във Великобритания, двете човешки инсулинови вериги бяха синтезирани с помощта на E.coli, които след това бяха свързани с биологично активна хормонална молекула. За да може едноклетъчният организъм да синтезира инсулинови молекули в своите рибозоми, е необходимо да му се предостави необходимата програма, т.е. да въведе в нея хормоналния ген.

Химически получават предшественика на биосинтеза на генното програмиране на инсулин или два гена, програмирайки поотделно биосинтеза на инсулинови вериги А и В.

Следващият етап е включването на гена за инсулинов прекурсор (или верижни гени поотделно) в генома на Е. coli, специален щам на Е. coli, отглеждан в лабораторни условия. Тази задача се изпълнява чрез генно инженерство.

Плазмидът се изолира от Е. coli чрез съответния рестрикционен ензим. Синтетичният ген се вмъква в плазмид (клониране с функционално активната С-крайна част на Р-галактозидаза Е. coli). В резултат на това E.coli придобива способността да синтезира протеинова верига, състояща се от галактозидаза и инсулин. Синтезираните полипептиди се разделят химически от ензима и след това се пречистват. При бактериите се синтезират около 100 000 инсулинови молекули на бактериална клетка.

Характерът на хормоналната субстанция, произвеждана от Е. coli, се определя от това кой ген се вкарва в генома на едноклетъчния организъм. Ако генът на инсулиновия прекурсор е клониран, бактерията синтезира инсулиновия прекурсор, който след това се подлага на третиране с рестрикционен ензим, за да се премахне прептата с изолирането на С-пептида, което води до биологично активен инсулин.

За да се получи пречистен човешки инсулин, хибридният протеин, изолиран от биомасата, се подлага на химично-ензимна трансформация и съответното хроматографско пречистване (първичен, гелпроникващ, анионообмен).

Рекомбинантният инсулин беше получен в Института на RAS, използвайки генетично инженерни щамове на E.coli. От биомасата се отделя прекурсор, хибриден протеин, експресиран в количество от 40% от общия клетъчен протеин, съдържащ препроинсулин. Неговата трансформация в инсулин in vitro протича в същата последователност като in vivo - водещият полипептид се разцепва, препроинсулинът се превръща в инсулин чрез окислителни сулфитолизни етапи, последвано от редуктивно затваряне на три дисулфидни връзки и ензимно изолиране на С-пептид свързване. След серия от хроматографски пречиствания, включително йонообмен, гел и HPLC, се получава човешки инсулин с висока чистота и естествена активност.

Може да се използва щам с нуклеотидна последователност, вградена в плазмид, експресираща слят протеин, който се състои от линеен проинсулин и протеинов фрагмент Staphylococcus aureus А, прикрепен към неговия N-край.

Отглеждането на наситената биомаса на клетките от рекомбинантния щам осигурява началото на производството на хибридния протеин, изолирането и последователната трансформация на които в тубата води до инсулин.

Друг начин също е възможен: в бактериална експресионна система се получава слят рекомбинантен протеин, състоящ се от човешки проинсулин и полихистидинова опашка, свързан с него чрез метионинов остатък. Изолира се като се използва хелатна хроматография върху Ni-агарозни колони от включени тела и се усвоява с цианоген бромид.

Изолираният протеин е S-сулфониран. Картографирането и масспектрометричният анализ на получения проинсулин, пречистен чрез йонообменна хроматография на анионообменник и RP (обратна фаза) HPLC (високоефективна течна хроматография), показва наличието на дисулфидни мостове, съответстващи на дисулфидните мостове на естествен човешки проинсулин.

Напоследък се обръща голямо внимание на опростяването на процедурата за производство на рекомбинантен инсулин чрез методи за генно инженерство. Например, възможно е да се получи слят протеин, състоящ се от лидерния пептид на интерлевкин 2, прикрепен към N-края на проинсулина чрез лизинов остатък. Протеинът е ефективно експресиран и локализиран в включените тела. След изолирането протеинът се разцепва с трипсин, за да се получи инсулин и С-пептид.

Полученият инсулин и С-пептид се пречистват чрез RP HPLC. При създаване на фузионни структури, масовото съотношение на протеиновия носител към целевия полипептид е много важно. С-пептидите са свързани чрез принципа на главата-опашка, използвайки аминокиселинни спейсери, носещи Sfi I рестрикционния сайт и два аргининови остатъка в началото и в края на спейсера за последващо разцепване на протеина с трипсин. Продуктите за HPLC разцепване показват, че разцепването на С-пептида е количествено и това прави възможно използването на метода на мултимерни синтетични гени за получаване на целеви полипептиди в промишлен мащаб.

Захарен диабет е хронично заболяване, причинено от абсолютен или относителен инсулинов дефицит. Характеризира се с дълбоко метаболитно нарушение на въглехидратите с хипергликемия и глюкозурия, както и други метаболитни нарушения в резултат на редица генетични и външни фактори.

Инсулинът досега служи като радикален и в повечето случаи единственият начин за поддържане на живота и увреждането на хората с диабет. Преди получаване и въвеждане на инсулин в клиниката през 1922-1923. Пациенти с диабет тип I чаках летален изход от една до две години от началото на заболяването, въпреки употребата на най-изтощителните диети. Пациенти със захарен диабет тип I се нуждаят от заместващо лечение през целия живот с инсулин. Прекратяването поради различни причини за редовното въвеждане на инсулин води до бързо развитие на усложнения и предстояща смърт на пациента.

В момента диабетът по отношение на разпространението е на 3-то място след сърдечно-съдови и онкологични заболявания. Според Световната здравна организация разпространението на диабета сред възрастното население в повечето райони на света е 2-5% и има тенденция за увеличаване на броя на пациентите почти два пъти на всеки 15 години. Въпреки очевидния напредък в областта на здравеопазването, броят на инсулинозависимите пациенти се увеличава всяка година и в момента само в Русия е около 2 милиона души.

Създаването на лекарства от вътрешен човешки генетичен инсулин открива нови възможности за решаване на много от проблемите на диабетологията в Русия, за да спаси живота на милиони хора с диабет.

Биотехнология: Учебник за гимназии / Ed. NS Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Висше училище, 1987, с. 15-25.

Човешки инсулин с генно инженерство. Подобряване на ефективността на хроматографското разделяне, използвайки принципа на бифункционалност. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вълфсон А.Н. // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, No.

Glick B., Pasternak J. Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение. М.: Мир, 2002.

Егоров Н. С., Самуилов В. Д. Съвременни методи за създаване на индустриални щамове на микроорганизми // Биотехнология. Vol. 2. М.: Висше училище, 1988. 208 с.

Имобилизация на трипсин и карбоксипептидаза В върху модифициран силициев диоксид и тяхното използване за превръщане на рекомбинантния човешки проинсулин в инсулин. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Химически фармацевтични продукти. J., 1995 - 29, No. 1, pp. 61 - 64.

Молекулярна биология. Структура и функция на протеините / Степанов В. М. / / Москва, СОУ, 1996.

Основи на фармацевтичната биотехнология: Учебно ръководство / ЕТС. Прищеп, В.С. Chuchalin, K.L. Зайков, Л.К. Михалев. - Ростов на Дон: Феникс; Томск: Издателство НТЛ, 2006.

Синтез на инсулинови фрагменти и изследване на техните физико-химични и имунологични свойства. / Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н., Максютов А.З., Тузикова Н.А., Сабиров А.Н. // Bioorganic Chemistry, 1997–23, No. 12, pp. 953–960.

Правилник за производството на генетично модифициран метод за инсулин

Начало> Представяне> Медицина, здраве

Държавна образователна институция

висше професионално образование

Курски държавен медицински университет

Федерална агенция за здраве и социално развитие

Катедра по фармацевтични технологии

за получаване на генетично модифициран инсулин, използвайки рДНК биотехнология

Студент 5-ти клас

Маравина И.Н.

Раздел I. Характеристики на крайния продукт 3

Раздел II. Характеристики на суровините 5

Раздел III. Схема за химическо производство 6

Раздел IV. Технологична схема на производство 7

Раздел V. Схема на производствения процес и спецификация

Раздел VI. Заявление за процес 10

Раздел VII. Методи за анализ 14

Раздел VIII. Безопасност, пожарна безопасност,

промишлена санитария 16

Раздел IX. Списък на производствените инструкции 17

Раздел I. Характеристики на крайния продукт

Суха инсулинова биомаса

Описание. Инсулиновите разтвори са бистра, безцветна или леко жълтеникава кисела течност (рН 2,0-3,5), която се приготвя чрез разреждане на кристалния инсулин във вода, подкиселена със солна киселина с добавка на глицерол и 0,25–0,30% разтвор на фенол или трикрезол. за консервиране.

Хипогликемичен агент, краткодействащ инсулин. Взаимодейства със специфичен рецептор във външната мембрана на клетките и образува инсулинов рецепторен комплекс. Чрез активиране на cMS биосинтезата в мастните клетки и чернодробните клетки, или директно проникване в мускулните клетки, инсулин-рецепторният комплекс стимулира вътреклетъчните процеси, включително синтез на редица ключови ензими (хексокиназа, пируват киназа, гликоген синтетаза и др.). Намаляването на кръвната глюкоза се дължи на увеличаване на вътреклетъчния транспорт, повишена абсорбция и абсорбция от тъканите, стимулиране на липогенезата, гликогеногенеза, протеинов синтез, намаляване на нивото на производство на глюкоза от черния дроб и т.н. фактори (от доза, метод и място на инжектиране). След p / до началото на ефекта - след 0.5 часа, максималният ефект - след 1-3 часа, продължителността на действие - 8 часа.

Тип 1 захарен диабет (инсулинозависим). Захарен диабет тип 2 (неинсулинозависим): стадий на резистентност към перорални хипогликемични средства, частична резистентност към тези лекарства (по време на комбинирана терапия), интеркурентни заболявания, бременност.

В началото на терапията - нарушено зрение, подуване на крайниците. С въвеждането на прекалено големи дози инсулин или нарушение на диетата (пропускане на хранене), както и прекомерни упражнения, хипогликемия (студена пот, бледа кожа, нервност, тремор, тревожност, прекомерна умора или слабост, дезориентация, замаяност, главоболие, изразено чувство на глад, временно увреждане на зрението, гадене, тахикардия, в тежки случаи - загуба на съзнание, кома). Системни алергични реакции: повишено изпотяване, повръщане, затруднено дишане, сърцебиене, замаяност.

Срок на годност - 1 година от датата на производство.

Раздел II. Характеристики на суровините

Вериги от гени, кодиращи синтеза на вериги А и В

Химически синтезирани

Културата трябва да бъде чиста

Четирислойни хартиени торби

Тъкани от памучна лента

Раздел III. Схема за химическо производство

Отсъстват химически трансформации в производството на генетично модифициран инсулин.

Раздел IV Технологична схема за производство на инсулин

Подготовка на помещения и оборудване

Санитарно преработвателно производство

Подготовка на технологично облекло

Синтез на вериги А и В

Въвеждането на гени в плазмида

Въвеждане на r-ДНК в разрешената клетка

Хранителен препарат

Култивиране на култура на суспензия

Получаване на молекула инсулин

Съгласно показателите на FS

Инструментална производствена схема и спецификация на оборудването

1 - Химичен реактор

2 - Въвеждане на гени в плазмида

4 - Непрекъснато звено за стерилизация

5 - Индустриален биореактор

6 - Избор на вериги

7 - Хроматографска инсталация

8 - получаване на инсулинова молекула

9 - Сушилня за замразяване

10 - Аналитична таблица

Раздел VI. Описание на процеса

BP 1. Подготовка на водата

Мембранни дестилатори са предназначени за получаване на обезсолена вода, която отговаря на изискванията на ГОСТ 6709-97 "Дестилирана вода". Производителност на дестилаторите - от 3 до 15 л / час (лабораторни инсталации в икономичен комплект), както и от 5-30 л / ч (лабораторни инсталации). Процесът на филтриране включва следните етапи: предварителна обработка на активен въглен, мембранна филтрация и деионизация на вода с използване на йонообменни смоли. Предварителният филтър премахва суспендирани частици, хлор, високо молекулно органично вещество и йони на тежки метали от входящата вода от чешмата. Мембранната филтрация се основава на явлението обратна осмоза, при което водата, преминаваща през полупропусклива мембрана, се пречиства от разтворени в нея соли, органични примеси с ниско молекулно тегло, както и бактерии и микроорганизми. На филтъра с йонообменни смоли има пълно пречистване на филтрата от разтворени соли.

BP 2. Санитарна обработка на продукцията.

ВР 2.1. В помещенията за производство на стерилни лекарствени форми се поставят следните изисквания:

Трябва да се съхранява в безупречна чистота, да подлежи на задължително ежедневно, както и общо почистване и периодични ремонти;

Може да бъде изложено на UV-лъчение за дезинфекция на въздуха, използвайки стационарни или преносими облъчватели;

Трябва да има осветление, температура, влажност и вентилация, които нямат пряко или непряко отрицателно въздействие върху качеството на готовата продукция;

Трябва да съдържа необходимия минимум за провеждане на производствения процес на количеството оборудване и обзавеждане;

Свързването между стените, пода и тавана трябва да има закръглена форма;

В помещенията на I и II класове на чистота не трябва да има открити комуникации, въздуховоди;

Помещенията от по-висок клас чистота трябва да се намират в стая с по-нисък клас чистота. Достъпът на персонал и суровини до чиста стая се извършва само чрез въздушни портали, които са снабдени със стерилен въздух по схемата „отгоре надолу”;

Трансферът на крайния продукт трябва да се извърши с помощта на конвейер, преминаващ през стените.

BP 2.2. Подготовка на оборудването

Изисквания за подготовка на оборудването:

Оборудването трябва да бъде проектирано и поставено по такъв начин, че неговата експлоатация, поддръжка и ремонт да могат да се извършват извън „чистите“ помещения;

Оборудването, използвано за работа в асептични условия, трябва да има записващи устройства за наблюдение на параметрите на процеса и наличието на алармени устройства за неговата неизправност;

Оборудването трябва да бъде почистено, дезинфекцирано и, ако е необходимо, стерилизирано;

Оборудването трябва да се следи за микробиологична чистота;

Работната повърхност на оборудването трябва да бъде гладка, от нетоксичен и корозивен материал.

ВР 2.3. Обучение на персонала

Изисквания към персонала:

Персоналът трябва да има известни минимални познания за правилата за хигиена, санитария и ДПП;

Не се допускат работници с инфекциозни заболявания, открити рани по кожата и носители на патогенна микрофлора;

Забранено е да се говори, да се яде храна, да се движи бързо на работното място;

Строго спазвайте личната хигиена, отстранявайте козметиката от лицето и махнете бижутата преди да влезете в "чистата" стая;

Вземете душ, измийте и почистете ръцете си с дезинфектанти, сложете комплект стерилни технологични дрехи и обувки.

BP 3. Синтез на вериги А и В.

Синтезът на веригите се извършва по химичен метод. Верига А съдържа 21 аминокиселинни остатъци, остатъци от верига В-30

BP 4. Въвеждане на гени в плазмида.

За да може плазмидът да приеме чужд ген, неговата верига се нарязва с рестрикционни ензими. За свързване на гените, кодиращи синтеза на вериги А и В, се използват олигозахаридни остатъци с различна дължина - линкери и адаптери. Когато молекулата е затворена, можете да я въведете в разрешителна клетка.

BP 5. Въвеждането на r-ДНК в разрешената клетка.

Въвеждането на р = ДНК в клетката на E.coli се извършва чрез микроинжекция: плазмид, съдържащ векторна ДНК, се инжектира в клетка на E.coli със специална ултратънка стъклена игла.

TP 6. Подготовка на хранителна среда

Основната хранителна среда за култивиране на културата на E.coli е бульон според Miller. Състав: казеин хидролизат, дрождев екстракт, натриев хлорид, агар-агар. Крайната стойност на рН (при 25 ° С) е 7.0 ± 0.2. Използва се също бульон Hottinger. Съставки: Хоттингер хидролизат, натриев хлорид, дестилирана вода.

Стерилизацията на хранителната среда се извършва в машина за непрекъсната стерилизация - ONS. Хранителната среда последователно преминава през нагряващата секция, задържащата секция и охлаждащата секция.

TP 7. Култивиране на суспензионна култура

Отглеждането на биокултури се извършва в биореактори, суспензионна култура, в която се смесва поради подаването на въздух в биореактора. Процесът се провежда в полу-периодичен режим, когато определено количество прясна хранителна среда се добавя постоянно към биореактора и в същото време се взема същия обем клетъчна суспензия.

TP 8. Изолиране на тъканна култура.

Отделянето на тъканната култура от хранителната среда се извършва чрез метод на утаяване (утаяване) в седиментатори, като се осигурява по-дълбоко разделяне чрез филтриране на нежен метод за запазване на целостта на културните клетки.

Инсулинът се пречиства чрез хроматографски методи: фронтално, гелно проникване, анионообмен. Пречистване на инсулин и неговите производни на сорбенти със силни катионно-обменни свойства (например SP-Sepharose FF) може да се използва за буферни системи на основата на амониев ацетат с ниско съдържание на карбамид (до 2 М или по-малко).

TP 10. Получаване на молекула инсулин

Избрани и пречистени вериги са сгънати и окислени, което осигурява образуването на подходящи дисулфидни мостове.

Сушенето на продукта се извършва в сушилня за замразяване.

TP 12. Оценка на качеството на крайния продукт.

Външен вид (както е описано), активност (биологичен метод).

UMO 13. Опаковане, етикетиране, изпращане.

Инсулиновата активност се измерва в единици за действие (ED) или в международни единици на действие (IU - руски или IU - английски или UI - френски). 1 единица отговаря на активността на 1/24 mg (41.66 μg) кристален инсулин.

През 1922 г. Фредерик Бантинг предлага инсулиновата единица да се разглежда като броя на кубичните сантиметри екстракт от панкреаса, който в рамките на 2-4 часа довежда здрав заек до хипогликемия с ниво на концентрация 2,5 mmol / L. Малко по-късно през същата година същият екип предложи „мишка” - количеството инсулин, необходимо за привеждане на половината от експерименталната група мишки в конвулсии (изследователите тук първоначално са действали по аналогия с LD50).

На следващата година Международният комитет по стандартизация прие дефиницията на звеното за инсулиново действие: "Количеството инсулин, необходимо за понижаване на нивото на кръвната захар до нивото, при което гърчовете започват при зайци с тегло 2 kg, които не са били хранени в продължение на 24 часа." Това звено, в чест на групата на Торонто от Бантинг и Бест, е обявено за Торонто инсулинова единица за действие.

През 1925 г. е въведен първият международен стандарт, който установява, че една единица инсулиново действие е количество, еквивалентно на 1/8 mg кристален инсулин.

Поради големия напредък в пречистването на инсулина и неудобството от използването на такова голямо звено през 1936 г., Комитетът на Лигата на нациите одобри нов международен стандарт за инсулиновото действие, който приравнява единицата с 1/22 mg кристален инсулин. През 1952 г. стандартът отново се променя и 1 единица се равнява на 1 / 24,5 mg кристален инсулин, а през 1958 г. се появява четвъртият стандарт (1 U е равен на 1/24 mg кристален инсулин). СЗО през 1982 г. направи най-новите корекции на стандарта, които не се отразяват на дефиницията на единицата, но се отнасят само до промени, свързани с появата на човешки генетично инженерни инсулин.

Раздел VIII. Безопасност, пожарна безопасност и

Всеки работник и инженер-работник при получаване на работа трябва да преминат основно обучение. Първоначалният инструктаж се извършва от бригадира или от капитана съгласно следната програма:

Основните разпоредби на законодателството за защита на труда, безопасност, промишлена санитария;

Целта и процедурата за използване на специално облекло и лични предпазни средства;

Задължения на работното място;

Изисквания за правилна организация и поддържане на работното място;

Общи правила за електрическа безопасност, стойността на вентилацията и правила за използване на вентилационни системи;

Запознаване с технологичния процес, оборудването на устройството и всички опасни обекти.

Цялото електрическо оборудване трябва да отговаря на изискванията на "Правилата за експлоатация на електрическото оборудване". Електрическото оборудване трябва да бъде заземено. Всички производствени и сервизни помещения, инсталации, съоръжения трябва да бъдат снабдени с пожарогасително оборудване и противопожарно оборудване.

Допускането на неупълномощени лица в магазина е забранено.

Раздел IX. Списък на производствените инструкции

Работни инструкции за санитарна обработка на помещенията.

Инструкции за безопасност, промишлена санитария и пожарна безопасност.

Инструкции за подготовка, доставка и получаване на ремонт на оборудване.

Инструкции за получаване на суровини и помощни материали;

План за отстраняване на злополуки.

Инструкции за регенериране на разтвора.

Работни инструкции за оператора на бутилките за измиване, сушене и стерилизация.

Инструкции за механика за ремонт и поддръжка на тръбопроводи.

Технология на производството на инсулин

INSULIN.docx

Глава 1. Литературен преглед

1.3. Спринцовки, химикалки и инсулинови дозатори

1.4 Техника за инжектиране на инсулин ……………………………………...

Фактори, влияещи на абсорбцията и действието на инсулина.........

1.6. Усложнения на инсулиновата терапия …………………………………….,

1.7. Инсулинова опаковка

1.8. Съхранение на инсулин.

1.9. Съвременни начини за подобряване на инсулиновата терапия...

Глава 2. Експериментална част

Инсулин (от латински. Insula - остров) - пептиден хормон, се образува в бета-клетките на островчета Лангерханс на панкреаса. Той има многостранен ефект върху метаболизма в почти всички тъкани.

Основната функция на инсулина е да осигури пропускливостта на клетъчните мембрани за глюкозните молекули. В опростена форма можем да кажем, че не само въглехидратите, но и всички хранителни вещества се разделят на глюкоза, която се използва за синтезиране на други молекули, съдържащи въглерод, и е единственият вид гориво за клетъчните електроцентрали - митохондрии. Без инсулин пропускливостта на клетъчната мембрана до глюкоза пада 20 пъти, а клетките умират от глад и излишната захар, разтворена в кръвта, отрови тялото.

Увреждането на секрецията на инсулин, дължащо се на деструкцията на бета-клетките - абсолютен инсулинов дефицит - е ключов елемент в патогенезата на захарен диабет тип 1. Нарушаването на ефекта на инсулина върху тъканта - относително дефицит на инсулин - има важно място в развитието на диабет тип 2.

Броят на хората с диабет в световен мащаб е 120 милиона (2,5% от населението). На всеки 10-15 години броят на пациентите се удвоява. Според Международния институт по диабет (Австралия) до 2010 г. в света ще има 220 милиона пациенти. В Украйна има около 1 милион пациенти, от които 10-15% страдат от най-тежкия инсулинозависим диабет (тип I). В действителност, броят на пациентите е 2-3 пъти повече поради скрити недиагностицирани форми.

Историята на откриването на инсулин е свързана с името на руския лекар И.М. Соболев (втората половина на 19-ти век), който доказа, че нивото на захар в човешката кръв се регулира от специален хормон на панкреаса.

През 1922 г. инсулин, изолиран от панкреаса на животно, е представен за първи път на десетгодишно диабетично момче. резултатът надмина всички очаквания, а година по-късно американската фирма Eli Lilly пусна първия животински инсулинов препарат.

След получаването на първата индустриална партида инсулин през следващите няколко години се пресича огромен начин за неговото изолиране и пречистване. В резултат на това хормонът стана достъпен за пациенти с диабет тип 1.

През 1935 г. датският изследовател Hagedorn оптимизира действието на инсулина в организма, като предлага продължително лечение.

Първите инсулинови кристали са получени през 1952 г., а през 1954 г. английският биохимик Г.Сенгер дешифрира структурата на инсулина. Разработването на методи за пречистване на хормона от други хормонални вещества и продукти на инсулинова деградация направи възможно получаването на хомогенен инсулин, наречен еднокомпонентен инсулин.

В началото на 70-те години Gg. Съветски учени А. Yudaev и S. Shvachkin предложи химически синтез на инсулин, обаче, прилагането на този синтез в промишлен мащаб е скъпо и нерентабилно.

В бъдеще се наблюдава прогресивно подобряване на степента на пречистване на инсулините, което намалява проблемите, причинени от инсулинови алергии, нарушена бъбречна функция, зрително увреждане и имунна инсулинова резистентност. Най-ефективният хормон е необходим за заместителна терапия при захарен диабет - хомоложен инсулин, т.е. човешки инсулин.

През 80-те години напредъкът в молекулярната биология дава възможност да се синтезират и двете човешки инсулинови вериги, използващи E.coli, които след това са свързани в биологично активна хормонална молекула, а рекомбинантният инсулин е получен в Института по биоорганична химия на Руската академия на науките, използвайки генетично инженерни щамове E.coli.

Целта на моята работа: Изследването на инсулинови препарати, представени на нашия пазар, техните предимства и недостатъци.

Задачи: Разглеждане на процеса на получаване на инсулин в промишленото производство.

Глава 1. Литературен преглед

1.1 Получаване на инсулин

Човешкият инсулин може да се произвежда по четири начина:

1) пълен химически синтез;

2) извличане от панкреаса на човек (и двата метода не са подходящи поради неефективност: недостатъчно развитие на първия метод и липса на суровини за масово производство по втория метод);

3) чрез полусинтетичен метод, използващ ензимно-химично заместване в позиция 30 на В-веригата на аминокиселината аланин в свински инсулин с треонин;

4) биосинтетичен метод за генно инженерство. Последните два метода позволяват да се получи човешки инсулин с висока чистота.

Помислете за получаването на биосинтетичен инсулин от гледна точка на предимствата на този метод.

Така че, ползите от получаване на инсулин биосинтетично.

Преди въвеждането на метода за производство на инсулин, използвайки рекомбинантни микроорганизми в индустрията, имаше само един начин за получаване на инсулин - от панкреасните жлези на говеда и свине. Инсулин, получен от панкреаса на говедата, се различава от човешкия инсулин с 3 аминокиселинни остатъка, а инсулин, получен от свински жлези, е само един аминокиселинен остатък, т.е. той е по-близо до човешкия инсулин. Въпреки това, с въвеждането на протеини, които се различават по структура от човешки протеини, дори и при такава незначителна експресия, могат да се появят алергични реакции. Такъв инсулин като чужд протеин може също да бъде инактивиран в кръвта от получените антитела.

В допълнение, за да се получи 1 килограм инсулин, се изискват 35 хиляди прасета (ако е известно, че годишната нужда от инсулин е 1 тон от лекарството). От друга страна, същото количество инсулин може да бъде получено биосинтетично чрез биосинтеза в 25 кубичен ферментатор, използвайки рекомбинантния микроорганизъм Escherichia coli.

Биосинтетичният метод за получаване на инсулин се прилага в началото на 80-те години

Нека се спрем на схемата за производство на рекомбинантен инсулин (Eli Lilli- Eli-Lilly, Съединени американски щати):

Етап 1. Чрез химически синтез се създават нуклеотидни последователности, които кодират образуването на А и В вериги, т.е. създават се синтетични гени.

2. етап. Всеки от синтетичните гени се въвежда в плазмид (ген, синтезиращ верига А се въвежда в един плазмид, и ген, синтезиращ верига В се въвежда в другия плазмид).

3. етап. Въведете гена, кодиращ образуването на ензима бетагалактозидаза. Този ген е включен във всеки плазмид, за да се постигне енергична репликация на плазмиди.

4. етап. Плазмидите се въвеждат в клетка Escherichia coli - Escherichia coli и се получават две култури-продуценти, една култура синтезира А верига, втората В верига.

5. етап. Поставят се две култури във ферментатор. В сряда се добавя галактоза, която индуцира образуването на ензима бетагалактозидаза. В този случай плазмидите активно се репликират, образувайки много копия на плазмиди и следователно много гени, синтезиращи А и В веригите.

6. етап. Клетките лизират, секретират А и В веригите, които са свързани с бетагалактозидаза. Всичко това се третира с цианоген бромид и А и В веригите се отцепват от бета галактозидазата. След това направете допълнително пречистване и селекция на А и В вериги.

7. етап. Цистеинови остатъци се окисляват, свързват се и се приготвят инсулин.

Инсулин, получен по този начин, е човешки инсулин в своята структура, която от самото начало на терапията намалява до минимум появата на алергични реакции.

За да се получи пречистен човешки инсулин, изолираният от биомасата хибриден протеин се подлага на химично-ензимна трансформация и подходящо хроматографско пречистване (фронтално, гелообразно проникване, анионообмен).

В Института на Руската академия на науките е получен рекомбинантен инсулин, използващ генетично модифицирани щамове на Е. coli, методът се състои в синтеза на неговия биологичен прекурсор на проинсулин, което прави възможно да не се извършва отделен синтез на инсулин А и В вериги. За производството на про-инсулиновата част на молекулата в Е. coli. плазмидът се въвежда (той се получава чрез вмъкване на естествена или чужда ДНК - така се получава рекомбинантна РНК молекула). Плазмидът осигурява синтеза на рекомбинантен протеин, който е лидерна последователност и фрагмент от протеина, както и човешки проинсулин с метионинов остатък (аминокиселина) между тях. Про-инсулиновата част на молекулата се отделя чрез третиране с бромен циан в оцетна киселина (разцепването се извършва селективно - с метиониновия остатък). Сместа (проинсулинова част и лидерна последователност) се отделя чрез хроматография. В следващия етап в получената последователност на проинсулина се извършва правилното взаимно подреждане на веригите А и В, което се извършва от централната част - пептид В. В следващия етап, свързващият С пептид се изолира чрез ензимен метод. След серия от хроматографски пречиствания, включително йонен обмен, гел и HPLC, получавам човешки инсулин с висока чистота и естествена активност.

Контролът на качеството на генетично инженерния инсулин предполага контрол на допълнителни показатели, характеризиращи стабилността на рекомбинантния щам и плазмид, отсъствието на външен генетичен материал в препарата, идентичността на експресирания ген и др.

1.2 Инсулинови препарати

Инсулиновите препарати варират в зависимост от източника. Свинският и говежди инсулин се различават от човешки по аминокиселинен състав: говежди в три аминокиселини и свински в един. Не е изненадващо, че при лечението с говежди инсулин нежеланите реакции се развиват много по-често, отколкото при лечение с свински или човешки инсулин. Тези реакции се изразяват в имунологична инсулинова резистентност, инсулинова алергия, липодистрофия (промяна в подкожната мастна тъкан на мястото на инжектиране).

Въпреки очевидните недостатъци на говежди инсулин, той все още се използва широко в света. И все пак, имунологично, недостатъците на говежди инсулин са очевидни: в никакъв случай не се препоръчва да се предписва за пациенти с ново диагностициран захарен диабет, бременни жени или за краткотрайна инсулинова терапия, например, в периоперативния период. Отрицателните качества на говеждия инсулин също се запазват, когато се използват в смес с свински, така че смесените (свински + говежди) инсулини също не трябва да се използват за лечение на тези категории пациенти.

Препаратите за човешки инсулин за химична структура са напълно идентични с човешкия инсулин.

Основният проблем на биосинтетичния метод за получаване на човешки инсулин е пълното пречистване на крайния продукт от най-малките примеси на използваните микроорганизми и техните метаболитни продукти. Новите методи за контрол на качеството гарантират, че човешките биосинтетични инсулини на горепосочените производители не съдържат никакви вредни примеси; по този начин степента им на пречистване и ефективност на понижаване на глюкозата отговарят на най-високите изисквания и са почти еднакви. Всякакви нежелани странични ефекти, в зависимост от примесите, тези лекарства нямат инсулин.

Инсулиновите препарати, в зависимост от началото и продължителността на действие, се разделят на следните групи:
1) инсулини с бързо и ултракоротно действие;
2) краткодействащи инсулини („прости” инсулини);
3) инсулини със средна продължителност ("междинни" инсулини);
4) дългодействащи инсулини;
5) "смесени" инсулини - комбинация от инсулини с различна продължителност на действие.

Броят на инсулиновите препарати с различни имена е няколко десетки, а нови инсулинови имена от различни чужди, а през последните години и местни фармацевтични компании се добавят годишно.

Бързи и свръхвисоки инсулини

Бързите и свръхкоротките инсулини в момента включват три нови лекарства - лиспро (хумалог), аспарт (novoid, novolog) и глулисин (apidra). Особеността им е в по-бързото начало и край на действието в сравнение с обикновения инсулин. Бързото начало на глюкозо-понижаващия ефект на нови инсулини се дължи на ускорената им абсорбция от подкожната мастна тъкан. Особеностите на новите инсулини позволяват да се намали времето между инжектирането и приема на храна, да се намали нивото на пост-хранителната гликемия и да се намали честотата на хипогликемията.

Началото на действие на lispro, aspart и glulissin възниква в диапазона от 5 до 10-15 минути, максималният ефект (пик на действие) е след 60 минути, продължителността на действие е 3 до 5 часа. Тези инсулини се прилагат 5 до 15 минути преди хранене или непосредствено преди него. Установено е, че прилагането на инсулин лиспро веднага след хранене също осигурява добър гликемичен контрол. Въпреки това е важно да се помни, че прилагането на тези инсулини 20 до 30 минути преди хранене може да доведе до хипогликемия.

Пациентите, които преминават към въвеждането на тези инсулини, трябва да контролират гликемичните нива по-често, докато се научат да съпоставят количеството въглехидрати, консумирани с дозата инсулин. По този начин, дозите на лекарствата се определят във всеки случай поотделно.

Ако се използва само хумалог (Insulin lispro), се използва нов бърз или новак (инсулин аспарт) или apidra (инсулин глулизин), които могат да се прилагат 4-6 пъти дневно и в комбинация с дългодействащи инсулини 3 пъти дневно. Прекомерната единична доза от 40 U е разрешена в изключителни случаи. Тези инсулини, налични във флакони, могат да се смесват в една и съща спринцовка с човешки инсулинови препарати с по-голяма продължителност на действие. Когато този високоскоростен инсулин се събира първо в спринцовката. Инжектирането е желателно да се направи веднага след смесването. Тези инсулини, произведени в патрони (специални ръкави), не са предназначени за приготвяне на смеси с друг инсулин.

Това е важно!
Новите високоскоростни инсулини са удобни за пациенти, водещи активен начин на живот, тяхната употреба се препоръчва при остри инфекции, емоционален стрес, увеличаване на количеството въглехидрати в храната, приемане на лекарства, които стимулират хипергликемия (тиреоидни хормони, кортикостероиди - преднизолон и др.), С други непоносимост инсулинови препарати или пост-хранителна хипергликемия, която е слабо податлива на действието на други инсулини. Трябва да се подчертае още веднъж, че бързодействащите инсулини трябва да се използват в пряка връзка с приема на храна.