Технология на производството на инсулин

Анализи

Инсулинът е един от хормоните, произвеждани от самия човешки организъм, по-специално от панкреаса. Нарушаването на секрецията на това вещество води до появата на такова сериозно заболяване като диабет. За лечението му използва синтетичен хормон, който дълго време е изолиран от панкреаса на добитъка. Въпреки това, технологията за производство на инсулин с помощта на много често срещана бактерия - Escherichia coli или гъбичка от дрожди се използва от доста време. Използването на този метод ви позволява да избегнете алергични реакции, причинени от чужд протеин, който има малка разлика от човека.

Технологична схема

Технологията на производство на инсулин включва всички основни етапи на производството на биотехнологични продукти. Резултатът е кристален краен продукт, който след това се използва за приготвяне на инжекционни разтвори, използвани при лечението на тежък захарен диабет тип I и II. Основният ефект на този хормон в организма се проявява в намаляване на съдържанието на глюкоза в кръвта.

Етапите на производство на инсулин ще бъдат както следва:

Предварителен. Извършва операции като подготовка и пречистване на вода и въздух, почистване на производствени помещения и стерилизация на оборудване, проверка на персонала, обработка на ръцете и издаване на стерилни обувки и облекло. Също така на предварителния етап се извършва първичен химичен синтез на молекулярните вериги, от които се сглобява протеинът. Верига А съдържа 21 аминокиселинни остатъци, а верига В съдържа 30 аминокиселини.
Приготвяне на хранителни разтвори и клетъчна култура. За да накара живата клетка да произведе необходимото съединение, се въвежда съответният ген. За целта плазмидът се отрязва от специални ензими, рестриктази и в него се ушиват гените, кодиращи синтеза на необходимите съединения. След това, като се използва метод за микроинжекция, модифицираният плазмид се връща в клетката.
Култивиране на клетъчна суспензия. Генетично модифицираните клетки се поставят в хранителен разтвор, съдържащ всички съставки, необходими за растеж и размножаване и подложени на стерилизация. Отглеждането на културата се извършва в специални биореактори, където се подава предварително пречистеният въздух. Периодично в реактора се добавя известно количество хранителен разтвор и в същото време се отнема същият обем клетъчна суспензия.
Разпределението на културата. Разделянето на флуидната и клетъчната култура се извършва чрез утаяване (утаяване) в специални седиментатори и след това филтриране, което позволява да се запази целостта на клетките.
Хроматографско пречистване на веществото. Извършва се върху подходящо оборудване, като се използват различни методи, по-специално фронтална, анионообменна и гелпроникваща хроматография.
Получаване на протеинова молекула. На същинския биотехнологичен етап настъпва синтез на непроизведена инсулинова молекула. И двата компонента на неговите вериги. Те се зашиват след окисляване и нагъване на получените вериги, което води до образуването на дисулфидни мостове.
Сушене чрез замразяване в специална пещ, след което полученият кристален препарат се проверява за съответствие със стандарта, опакован, етикетиран и изпратен на потребителя.

Нашата компания при благоприятни условия предлага готови производствени линии, в които напълно се спазва цялата технология на производство на инсулин. Благодарение на точните изчисления, техническата и информационната поддръжка, както и обучението на персонала в рамките на цялостна програма, компанията ще бъде печеливша и нейните продукти ще бъдат търсени.

Откриване на инсулин

Днес диабетът засяга повече от 400 милиона души на планетата, което е около 8% от възрастното население на земното кълбо. Според държавния регистър повече от 3,3 милиона души страдат от диабет в Русия (около 300 хиляди души страдат от диабет тип 1, а около 3 милиона души страдат от диабет тип 2). Малко вероятно е обаче тези цифри да отразяват реалната ситуация. Всички тези хора, които живеят всеки ден, разбират, че животът им зависи от инсулина.

Първите опити за лечение на диабет са направени преди нашата ера. Древногръцки и римски лекари, използвани за този масаж, гимнастика, бани, ароматерапия и много други. През 19-ти век е разработена диета с ниско съдържание на въглехидрати за диабетици. Първият опит за лечение на диабет с инсулинови инжекции е направен през 1921 година. Канадският учен Фредерик Бантинг стана първият човек, използвал хормона на инсулина, за да контролира диабета. Имаше само 32 кода, когато получи Нобелова награда за медицина. Той създава лекарството ефективно и без странични ефекти намалява нивото на глюкоза от 28,9 на 6,7 mmol / l. Този наркотик даде надежда за живот на мнозина.

През 1869 г. учен Павел Лангерган открива групи от клетки в панкреаса, които по-късно са кръстени на него "островите Лангерханс". Впоследствие инсулинът се изолира от клетките на тези островчета. Инсулинът е хормон, който регулира метаболизма, предимно на въглехидрати (захари), но също и мазнини и протеини. При диабет, дължащ се на недостатъчна експозиция на инсулин, настъпва комплексно метаболитно нарушение, повишава се нивото на кръвната захар (хипергликемия), захарта се екскретира в урината (гликозурия), а в кръвните кетонни тела се появяват кисели продукти с намалено изгаряне на мазнини.

След откриването на инсулин, много учени започнаха да разработват методи за почистване на това лекарство, тъй като онечистванията оказват вредно въздействие върху отслабеното тяло.

Agilent Technologies е световен лидер в аналитичното оборудване. Уредите за хроматографски и спектрален анализ за повече от година са помогнали на учените по света да разрешат жизнените проблеми на фармацевтичните продукти. Контролът на чистотата на инсулина не е изключение. Преди това за тези цели се използва класическа течна хроматография, като се получават напълно приемливи резултати:

След много изследвания, учените доказаха, че формираният инсулинов полипептид с молекулно тегло от около 6000, е ефективно идентифициран, използвайки най-новите разработки в областта на изключващата хроматография.

С този нов метод може да се сравни “добър инсулин”, който се съхранява при препоръчителни условия и “лош инсулин”. Когато две хроматограми са насложени една върху друга, се оказва, че в инсулиновия препарат, който се съхранява при неблагоприятни условия, целевата молекула се разрушава и вместо нея, на хроматограмата се идентифицират продукти на разлагане.

Разработване и унифициране на методи за анализ и стандартизация на инсулинови препарати с използване на реверсивна течна хроматография под високо налягане (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

Тази дисертационна теза трябва да отиде в библиотеката в близко бъдеще.
Уведомете за приемането

Тезата - 480 рубли., Доставка 10 минути, денонощно, седем дни в седмицата и празници.

Резюме - 240 рубли, доставка 1-3 часа, от 10-19 (московско време), с изключение на неделя

Пихтар Анатолий Василевич. Разработване и уеднаквяване на методи за анализ и стандартизация на инсулинови препарати с помощта на течна хроматография с обратна фаза (RP HPLC): дисертация. Кандидат на фармацевтичните науки: 15.00.02 / Пихтар Анатолий Василиевич; [Място на защита: Московска медицинска академия].- Москва, 2005.- 139 стр.: Ил.

Съдържание на дисертацията

ГЛАВА 1. Преглед на литературата 11

1. Ролята на инсулина в лечението на захарен диабет 11

2. Биосинтеза и биологично действие на инсулин 12

3. Обща характеристика на физикохимичните и фармацевтичните свойства на инсулин 15

4. Инсулинови препарати 24

5. Методи на производство, стандартизация и контрол на качеството на инсулиновите препарати 31

6. Използване на HPLC във фармацевтичния анализ на инсулин. 46

ГЛАВА 2. Декларация за проблема 50

ГЛАВА 3. Изследване на влиянието на различни фактори върху хроматографското поведение на инсулина при условията на RP HPLC 56

1. Методи и материали 57

2. Обсъждане на резултатите 62

2.1. Влияние на състава на буферния разтвор 62

2.2. Ефектът на концентрацията на натриев сулфат 68

2.3. Влияние на температурата на хроматографската колона 70

2.4. Ефект на органичния модификатор 75

2.5. Влиянието на дължината на алкиловия радикал на присадената фаза 80

2.6. Влиянието на дължината на хроматографската колона 80

ГЛАВА 4. Подобряване на фармакопейните методи за анализиране на инсулинови препарати въз основа на използването на RP HPLC 82

1. Избор на оптимални условия за хроматографско определяне на инсулин и неговите примеси в лекарствени препарати 82

2. Метрологични характеристики на метода 84

3. Прилагане на разработената методология за тестване на официални инсулинови препарати 95

ГЛАВА 5. Разработване на методи за анализ на инжекционни лекарствени форми на изофан-инсулин на базата на метода на PF HPLC t

1. Избор на условия за хроматографско определяне на протамин в лекарствените форми на изофан-инсулин 110

2. Изследване на хроматографски профили на протамини, изолирани от различни видове риби 121

3. Метод за определяне на протамин в изофан-инсулинови препарати 123

4. Валидиране на разработената методология 125

Общи заключения 136

Референции 139

Обща характеристика на физикохимичните и фармацевтичните свойства на инсулина

От химическа гледна точка инсулинът е малък глобуларен протеин с молекулно тегло до 6000 Da. В същото време трябва да се отбележи, че инсулинът е общоприето име за цялото семейство хомоложни протеини с естествен и изкуствен произход с обща характеристична биологична активност. Протеиновата природа на инсулина е създадена през 1928 г. [52]. Той е сред протеините, които произвеждат биуретната реакция и реакцията на Паули. Структурата на инсулина е напълно установена в началото на 50-те години. Елементарният химичен състав на инсулините с различен произход се характеризира с цифрите, дадени в таблица 1 [40].

Аминокиселинен състав. Повечето молекули инсулин съдържат 51 аминокиселинни остатъка, сред които са 17 аминокиселини, открити в повечето известни протеини.

Характерна особеност на аминокиселинния състав на говежди, свински и човешки инсулин е триптофанът и метионинът. Аминокиселинният състав на тези видове инсулин е представен в таблица 2 [40,46].

Непроменен към всички видове инсулин е съдържанието на цистин (6 полуцистинови остатъка). В допълнение, молекулата на инсулина от всички видове съдържа 6 амидни групи (аспарагин, глутамин).

При освобождаване на инсулин, заедно с основната фракция, могат да се наблюдават фракции на дезаминирани форми на инсулин. В киселата среда, в процеса на деамидиране, всичките 6 амидни групи могат да се разделят постепенно, а електрофоретичната и хроматографската мобилност на инсулиновите промени [40]. Образуването на дезаминирани форми на инсулин може да се прецени по резултатите от определянето на амоняка. За напълно амидна форма на инсулин се определя 6 mol амоняк на 1 mol протеин, а за деамидирани форми тази стойност може да бъде от 5 до 0.

Първичната структура на инсулина. Основната структура на инсулина е дешифрирана от групата на Сангер през 1945-1955. Използвайки редица хроматографски методи, които позволяват да се разделят и идентифицират различни пептиди, аминокиселини и техните производни, Сангер е в състояние да установи първичната структура на говежди инсулин [130,131,132,133,134,135]. По-нататъшни изследвания на инсулини с различен произход, използвайки различни физикохимични методи, включително метода на Едман за определяне на пълната аминокиселинна последователност в дълги пептиди, потвърдиха констатациите на Сангер и неговите съавтори за структурата на инсулин [bb].

До този момент първичната структура на инсулина е определена в представители на 24 вида, принадлежащи към 4 класа животни: бозайници, птици, риби и циклостоми [14]. Продължават изследванията на инсулина с различен произход [71,72,73].

Структурата на инсулина при различни животни е подобна, но не е идентична. В своята първична структура човешкият инсулин е подобен на прасе, куче, кашалот и заешки инсулин, които се различават само в една аминокиселина [40]. Той се различава от говежди инсулин с три аминокиселини. В по-голяма степен човешкият инсулин не е подобен на инсулин от гвинейската свиня, птици и риба [40]. Разликите в аминокиселинната последователност на човешки, свински и говежди инсулини са показани в Таблица 3.

Въпреки структурните различия, всички видове инсулини имат сходна биологична активност, т.е. причиняват хипогликемичен ефект. Въпреки това, степента на проявената биологична активност силно зависи от вида и е в диапазона от 11 IU / mg (трески от Северно море) до 62 IU / mg (пуйка и пилешки инсулин), докато активността на човешкия инсулин е около 25-30 IU / mg [40]. Колкото по-големи са разликите между видовете, толкова по-голяма е разликата в биологичната активност на съответния инсулин.

Функционално активна молекула инсулин се състои от две полипептидни вериги (А и В вериги), свързани с дисулфидни връзки; една връзка се образува от седмия аминокиселинен остатък на двете вериги, втората дисулфидна връзка се образува от 20-тия остатък на А-веригата и 19-тия остатък от В-веригата (Фигура 2). Освен това в молекулата на инсулина има трета дисулфидна връзка, която е вътрешна и свързва 6-ия и 11-ия А-верижен остатък [59,117].

Вторична структура С помощта на различни физико-химични и физични методи за изследване е показано, че молекулата на инсулина има силно подредена пространствена структура (конформация), която допринася за осъществяването на специфични биологични функции [14]. В молекулата на естествения инсулин, както cc-helix, така и p-fold листата присъстват едновременно. В допълнение, има области с нарушена структура и структура <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Когато киселинен разтвор на инсулин (рН 2.3-2.5) се загрява при температура от + 100 ° С и бързо се охлажда до -80 ° С, се образува така нареченият фибриларен инсулин - напълно неактивна форма на хормона [27]. Въвеждането на фибриларни инсулинови влакна в разтвор на активен инсулин предизвиква спонтанно количествено утаяване на инсулин под формата на фибрили [14,17].

Методи за производство, стандартизация и контрол на качеството на инсулиновите препарати

Получаване на животински инсулинови видове. Промишленото производство на говеждо и свинско инсулин е установено почти едновременно в редица страни, скоро след откриването на инсулин през 1921 г. [63]. Оттогава концепцията за получаване на инсулин остава практически непроменена (таблица б) [17, 18]. Суровините за производството на животински видове инсулин са панкреасът на говедата за клане, използвани за храна.

Най-важната задача при производството на инсулин е нейното пречистване - освобождаването на вещества от свързани примеси, които намаляват биологичната активност, причиняват имунологични реакции или са потенциално опасни за здравето на пациента. Например, след няколко години използване на слабо пречистен инсулин в кръвта на пациента, може да има до 5000 IU инсулин, свързан с антитела. Антителата към инсулина значително повлияват профила на неговото действие и по този начин допринасят за лабилния курс на диабета.

Първият метод за пречистване на инсулин се прекристализира в присъствието на цинкови соли. През 1945 г. е показано, че седемкратната рекристализация на инсулина значително намалява нивото на алергичните реакции при пациентите в сравнение с официалните инсулинови препарати по това време [63].

Хетерогенността на инсулиновите проби след кристализация и единична рекристализация е показана, използвайки различни методи: противотоково екстрахиране (РЕ), разпределителна хроматография (РХ), йонообменна хроматография (МОК), дисколектрофореза (DEP) и гел изключваща хроматография (GEC) [63].,

Установено е, че основните съпътстващи инсулинови примеси са: проинсулин, неговите междинни съединения, ковалентен инсулинов димер, моно-дисамидо инсулин, моноаргинин и моно-етилен, както и редица високомолекулни съединения с неинсулинова природа. Обобщено заключение от резултатите от проучванията, като се вземе предвид информацията за имунологичната активност на откритите примеси [138], беше заключението за необходимостта от допълнително пречистване на инсулиновите вещества, така че при анализиране с DEF и GEC методи, беше намерен един компонент - съответния инсулин.

За да се реши проблемът с пречистването на инсулин през 1950 г., беше предложен HEC метод, а през 1970 г. беше използван метод на анионобменна хроматография (AOX). Установено е, че пречистеният по метода на AOX инсулин съдържа около 500 ррт (части на милион) примеси с проинсулинова активност [137]. Допълнителното пречистване на инсулин чрез течна хроматография под високо налягане върху обратни фази (RP HPLC) намалява съдържанието на имуногенни фракции до границата на тяхното откриване [63].

Преглед на съвременните разработки в областта на хроматографското пречистване на инсулин е представен в [96]. Инсулин, пречистен, последователно, използвайки IOC и GEC, се нарича монокомпонентен инсулин [63]. Получаване на човешки инсулин. Търсенето на методи за получаване на човешки инсулин се дължи на две обстоятелства. От една страна, неотложността на суровинния проблем при производството на животински инсулин, от друга страна, бързото развитие на науката в тази област даде реална възможност да се осъществи идеята. През 1979 и 1981 почти едновременно с това са разработени два метода за получаване на човешки инсулин - биосинтетични и полусинтетични [102,108]. През 1981 г. компанията Ново Нордиск за първи път в света започва серийно производство на човешки полусинтетичен инсулин. Методът, използван от дружеството, се основава на ензимната и химичната смяна на Al в молекулата на свинския инсулин с остатъка от Tre [61]. Този метод е пряко зависим от получаването на необходимото количество свински инсулин, което намалява неговата икономическа стойност. Възможността за получаване на човешки инсулин чрез биосинтетичен метод се появи с разработването на рекомбинантна ДНК технология [10]. Работите по генетично инженерно производство на инсулин започнаха преди около 25 години. През 1978 г. се съобщава, че е получен щам на проинсу-линг на плъх, продуциращ E.coli. През 1979 г. проучванията на Genentech са в състояние да клонират в Е. coli гените, кодиращи аминокиселинни последователности. инсулинови вериги А и В, включени в р-хало-тацидазната област на pBR322 плазмида [10,102]. През 1981 г. е синтезиран проинсулинов ген-аналог на мини-С-проинсулин, в който 35-членният С-пептид е заменен с сегмент от шест аминокиселини: arg-arg-gly-ser-lys-arg и е показано неговото експресиране в Е. coli. През 1982 г. компанията Eli Lilly започва първото в света индустриално производство на човешки инсулин, използвайки две верижни технологии, разработени в сътрудничество с Genentech [102]. В момента е показана възможността за получаване на човешки инсулин с помощта на различни експресионни системи [3,10,101,102]. От икономическа гледна точка, използването на генетично модифицирани щамове на грам-положителни E.coli бактерии, много от които се считат за свръхпроизводители, е от особен интерес [3]. В същото време е постигнат значителен напредък с клетките на дрождите Saccharomices cerevisiae [3.75]. Таблица 7 изброява основните, общи за различните методи за производство на рекомбинантния човешки инсулин, етапите на технологичния процес [3,10,63].

Прилагане на разработената методология за тестване на официални инсулинови препарати

Течна хроматография под високо налягане (HPLC) е вариант на колонна течна хроматография, при която подвижната фаза - елуент - преминава през сорбента, запълващ колоната с висока скорост поради значително налягане (до 400x105 Pa) на входа на колоната [11].

Като начин за анализ на сложни смеси от вещества, HPLC се появи преди малко повече от 30 години. Използването на сорбенти с диаметър на частиците 3–10 μm води до рязко увеличаване на ефективността на хроматографското разделяне в сравнение с класическата версия на колонна течна хроматография. Следователно, HPLC често се нарича високоефективна течна хроматография (HPLC). Инструменталните характеристики на използването на HPLC са описани подробно в многобройни наръчници [49.50] и в съответните раздели на водещата фармакопея [79,150]. За HPLC е разработен и се произвежда широк спектър от сорбенти. Според авторите на проучването [51] - около 100 фирми в света произвеждат повече от 300 вида сорбентни имена. Историята, текущото състояние и перспективите за развитие на метода са разгледани в рецензии [51] и [77.78].

В различните си варианти методът HPLC се използва широко във фармацевтичния анализ (контрол на производството и тестване на качеството на лекарството). Методът е включен във всички водещи фармакопеи по света. Този метод е най-пълно описан в Европейската и Американската фармакопея. HPLC се използва за идентифициране на лекарства, за определяне на чистота, фракционен състав на молекулно тегло и количествен анализ. В US Pharmacopoeia 28 ed. около 30% от частните изделия включват използването на HPLC. В Европейската фармакопея 4-то изд. тази цифра е около 40%.

Първият хроматографски метод за тестване на инсулин е гел-изключваща течна хроматография при ниско налягане (GE ZhND). Принципът на разделяне при условията на HPLC се основава на различната способност на молекулите с различни размери да проникнат в порите на неутралния гел, който служи като стационарна фаза. Хидродинамичният диаметър на инсулиновия мономер и димер е пропорционален на тяхното молекулно тегло и е 2.69 и 5.50 nm, съответно [115].

През 1967 г., използвайки метода GE-IHDD, беше показано, че търговските препарати на инсулин, пречистени чрез кристализация, съдържат примеси с молекулно тегло, превишаващо молекулното тегло на инсулина [63]. На хроматограмите на свински инсулин бяха намерени три пика, условно означени като а-, Ь- и с-компоненти. Оттогава са предложени редица хроматографски системи за контрол на съдържанието на примеси с високо молекулно тегло в инсулинови препарати. Разделянето се извършва върху силно набъбващи агарозни ксерогели (Bio-Gel Р-30, Bio-Rad Lab.) Или декстран (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 М разтвори на оцетна киселина се използват като IF [127]. Високата чувствителност на тези сорбенти до сгъстяване при налягания, превишаващи налягането на набъбване на матрицата, прави тези материали неподходящи за работа в режим HPLC.

Използването на гел-изключваща течна хроматография при високо налягане (GE HPLC) за анализ на инсулин беше описано за първи път през 1980 г., след разработването на твърди макропорести сорбенти, съвместими с вода и издържащи високи налягания. В [151], разделянето се извършва на колони Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) в денатуриращи условия (комбинация от 7 М разтвор на карбамид, минерални киселини и не-йонни). детергенти). Необходимостта от инсулинов анализ при денатуриращи условия е свързана със способността на инсулина да агрегира в разтвор. За отделянето на инсулин при условията на HPLC HPLC е описано използването на "традиционната" елуент оцетна киселина [152]. Използването на оцетна киселина има няколко предимства - минимално въздействие върху нативната структура на отделените съединения, наличност, ниска цена, освен това, важен факт е способността на оцетната киселина да потиска асоциирането на инсулин.

Понастоящем HPLC ghvd е фармакопейна методика за мониторинг на съдържанието на високомолекулни примеси в вещества и готови лекарствени форми. Методът се използва и за определяне на съдържанието на протамин в изофан-инсулинови препарати.

Използването на HPLC върху обърнати фази (RP HPLC) за разделяне на говеда и свински инсулин за първи път демонстрира висока ефективност на този метод за анализ на инсулиноподобни пептиди с подобна структура.

Механизмът на разделяне на протеини и полипептиди в условията на RP HPLC се основава на различната хидрофобност на инсулиновите молекули и свързаните с тях примеси. Досега са описани няколко десетки методи за хроматографско разделяне на инсулин с различен произход и техните производни, включително проинсулин, панкреатични полипептиди, дезамидни производни, инсулинов димер. [126] показаха възможността за отделяне на инсулин от пилета, зайци, овце и кон. Инсулинът от човешки, говеждо и свинско месо също е разделен. Лойд и Коран публикуват метод за разделяне на говеждо, свинско, човешки инсулини и съответните им деамидирани форми [104].

Разделянето се извършва върху силикагелни сорбенти модифицирани, метилови, бутилови, октилови, октадецилови и фенилови групи в изократен или градиентен режим. Като PF се използват органични модификатори - ацетонитрил, метилов алкохол, изопропилов алкохол, смесени с водни буферни разтвори, съдържащи неорганични соли и реагенти на йонни пари. Откриването на пика се извършва главно по спектрофотометричен метод при дължина на вълната 190-220 nm, описани са и флуориметрични методи [103].

Анализът на веществото и готовите лекарствени форми на инсулин, използвайки RP HPLC, е описан в частни статии в Американската и Европейската фармакопея [79,150]. Методът се използва за тестване на лекарства от посочената група по отношение на "инсулинова автентичност", "сродни протеини", "количествено определяне" и "инсулин в разтвор".

Изследователската литература описва също използването на йонообменна и афинитетна хроматография за инсулинов анализ [44,102], но тези методи не са широко използвани във фармакопейната практика.

Изборът на условия за хроматографско определяне на протамин в лекарствените форми на изофан-инсулин

Увеличаването на PF йонната сила обикновено води до увеличаване на съотношенията на капацитета на инсулина, което може да се дължи на редица фактори: - увеличаването на йонната концентрация намалява степента на йонизация на заредените групи на протеиновата молекула, увеличавайки неговата хидрофобност / - високата концентрация на катионите допринася за скрининга на свободните силинолни групи на стационарната повърхност фаза, която отслабва неспецифичното електростатично взаимодействие на протонираните аминогрупи на протеина с матрицата; - високата йонна сила влияе върху пространствената структура на инсулина, в резултат на което се променя повърхността на взаимодействието със сорбента. Концентрацията на неорганични соли във FS влияе върху формата на пиковете и селективността на отделянето на инсулин и дезамидо-Asn-инсулин [143,144]. С изократно елуиране върху сорбент LiChrosorb Сіс с 0.1 М разтвор на натриев фосфат (рН 2.3), задоволителен резултат се постига само когато към буферния разтвор се добави натриев сулфат до концентрация от 0.1 М. Повечето методи за инсулинов анализ, включени във фармакопейни изделия и ND, използвайте PF на базата на буферни разтвори със съдържание на натриев сулфат равно на 0,2 M. Такова високо съдържание на натриев сулфат влияе отрицателно на възпроизводимостта на хроматографските резултати, дължащи се на стратификация на елуентите, още повече, силно концентрираните солни разтвори имат отрицателно въздействие върху хроматографското оборудване, което съкращава експлоатационния му живот. Като се има предвид, че фармакопейните методи за анализ са разработени преди повече от 20 години, изглежда интересно да се изследва хроматографското поведение на инсулин при OF-HPLC върху хроматографските сорбенти от последното поколение, в зависимост от концентрацията на натриев сулфат. В същото време те се опитват да разберат дали е допустимо намаляване на съдържанието на натриев сулфат в PF без значително влошаване на способността за разделяне на хроматографската система. В резултат на изследването е установено, че ефектът от концентрацията на натриев сулфат в PF е различен, в зависимост от вида на присадената фаза, както и от вида на инсулина. На сорбенти с присадени групи С4 и С селективността на сепарирането на пиковете на човешки инсулин и дезамидо-Asn-човешки инсулин не зависи от концентрацията на натриев сулфат в. Разтвор на буфер 1 в диапазона от 0.05 М до 0.2 М. На сорбента Diaspher-110-C18 селективността на сепариране на тази двойка пикове има максимум при 0.05 М и минимум при 0.1 М (диаграма 4). От друга страна, селективността на отделянето на животинските видове инсулин и техните съответни дезамидирани AsnA21 форми не зависи от йонната сила на разтвора, когато се разделя на сорбент Diaspher-110-C18. На сорбент с присадени групи С8 селективността нараства от 1.25 до 1.28 с повишаване на концентрацията на натриев сулфат (фигура 4). На сорбент с присадени групи С4 селективността на сепариране в говеждото инсулин е максимална при 0,1 М натриев сулфат и минимум 0,2 мкм. За свински инсулин няма изразен максимум при концентрация на натриев сулфат 0,1 М, в този случай увеличаване на йонния силите доведоха до намаляване на селективността на разделянето (фигура 4). Броят на ефективните теоретични плаки се увеличава с увеличаване на концентрацията на натриев сулфат. Изключение прави поведението на човешкия инсулин върху сорбента Diasfer-110-C8 (фигура 5). Степента на разделяне на пиковете на инсулин и дезамидо-Asn-инсулин нараства с увеличаване на йонната сила на FS, независимо от вида на инсулина и вида на присадената фаза (диаграма б). Чрез намаляване на концентрацията на натриев сулфат от 0.2 М до 0.1 М, степента на разделяне на избраната двойка пикове намалява средно с 5% за човешки и свински инсулини и с 10% за говежди инсулин. Предвид факта, че абсолютната стойност на степента на разделяне надвишава 2,0, измереното влошаване на капацитета за разделяне на колоната, според нас, не е значително. Следователно, концентрацията на натриев сулфат в буферния разтвор PF може да бъде намалена 2 пъти в сравнение с фармакопейните методи за анализ.

В повечето изследвания на анализа на протеини и пептиди, разделянето се извършва при стайна температура. Освен това някои автори посочват, че влиянието на температурата върху селективността на сепарацията е минимално [48]. С нарастването на температурата, обаче, ускорява се процесът на масов обмен между стационарните и подвижните фази, което води до намаляване на времето на задържане на пептидите и до стесняване на пиковете.

Инсулинова технология

Нарушаване на инсулиновата секреция. Използването на партньорска фотография. Схема за инсулин. Експресия на проинсулин в клетки на Е. coli. Подходи за решаване на проблема с диабета. Приносът на биотехнологията за промишленото производство на непептидни хормони.

Изпращайте добрата си работа в базата от знания е проста. Използвайте формата по-долу.

Студенти, студенти, млади учени, които използват базата от знания в обучението и работата си, ще бъдат много благодарни за вас.

Публикувано на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО НА ОБРАЗОВАНИЕТО И НАУКАТА НА РЕПУБЛИКА КАЗАХСТАН

КАЗАХСКИ АГРОТЕХНИЧЕСКИ УНИВЕРСИТЕТ СЛЕД S.SEYFULLIN

Катедра по микробиология и биотехнология

По дисциплината "Биотехнология мокроорганизмов"

По темата: технология за инсулин

Завършен: Мързъбек М? Лдир Курбанбек?

Проверено: Акимбаева А.К. (к. Б. Н.)

СЪКРАЩЕНИЯ И СИМВОЛИ

1. История на откритието

2. Получаване на инсулин в биотехнологията

3. Начини за получаване на човешки инсулин

4. Експресия на проинсулин в Е. coli клетки

5. Пречистване на инсулин

6. Дозировка и приложение

В тази курсова работа са използвани следните определения:

Протеинов носител - осигуряване на транспортиране на хибридния протеин в периплазменото пространство на клетката или културалната среда;

Афинитетният компонент - значително улеснява избора на хибриден протеин.

Инсулин (от латински. Insula - остров) - пептиден хормон, се образува в бета-клетките на островчета Лангерханс на панкреаса.

Интерлевкините са група цитокини, синтезирани главно от левкоцити (поради тази причина е избран крайният "леукин").

Проинсулинът е предшественик на инсулин, синтезиран от В-клетките на островния апарат на панкреаса.

Хроматография (от гръцки. Chroma, хроматос - цвят, боя), физико-химичен метод за разделяне и анализ на смеси, базиран на разпределението на техните компоненти между двете фази - стационарни и подвижни (елуент), протичащи през неподвижния.

Инкапсулирането - механизъм на езика за програмиране, който ограничава достъпа до компонентите, съставляващи обект (методи и свойства), ги прави частни, т.е. достъпни само в рамките на обект.

Слят протеин (фузионно протеин, също химерен протеин на съединение) е протеин, получен чрез комбиниране на два или повече гени, които първоначално кодират отделни протеини.

Хормони (от гръцки. Hormao - привеждане в действие, индуциране), хормони, биологично активни вещества, произведени от ендокринните жлези или ендокринни жлези, и секретирани от тях директно в кръвта.

Захарен диабет е група от ендокринни заболявания, развиващи се в резултат на абсолютна или относителна недостатъчност на хормона инсулин.

Соматостатинът е хормон на делта-клетките на панкреатичните острови на Лангерханс, както и един от хормоните на хипоталамуса.

Радиоиммунен анализ е метод за количествено определяне на биологично активни вещества (хормони, ензими, лекарства и др.) В биологични течности, базиран на конкурентното свързване на желаните стабилни и подобни на тях радионуклидно маркирани вещества със специфични свързващи системи.

СЪКРАЩЕНИЯ И СИМВОЛИ

HPLC - високоефективна течна хроматография

сДНК - комплементарна дезоксирибонуклеинова киселина

Основната функция на инсулина е да осигури пропускливостта на клетъчните мембрани за глюкозните молекули. В опростена форма може да се каже, че не само въглехидратите, но и всички хранителни вещества, в крайна сметка, се разделят на глюкоза, която се използва за синтезиране на други молекули, съдържащи въглерод, и е единственият вид гориво за клетъчните електроцентрали - митохондрии. Без инсулин пропускливостта на клетъчната мембрана до глюкоза пада 20 пъти, а клетките умират от глад и излишната захар, разтворена в кръвта, отрови тялото.

Увреждането на секрецията на инсулин, дължащо се на деструкцията на бета-клетките - абсолютен инсулинов дефицит - е ключов елемент в патогенезата на захарен диабет тип 1. Нарушаването на ефекта на инсулина върху тъканта - относително дефицит на инсулин - има важно място в развитието на диабет тип 2.

Използването на афинитетна хроматография значително намалява съдържанието на замърсяващи протеини в препарата с по-високо молекулно тегло от инсулина. Такива протеини включват проинсулин и частично разцепени проинсулини, които са способни да индуцират производството на антиинсулин антитела.

Употребата на човешки инсулин от самото начало на терапията намалява до минимум появата на алергични реакции. Човешкият инсулин се абсорбира по-бързо и, независимо от формата на лекарството, има по-кратка продължителност на действие от животинския инсулин. Човешките инсулини са по-малко имуногени от свинското, особено смесените говежди и свински инсулини.

Целта на тази курсова работа е да изучава технологията на инсулина. За постигането на следните цели бяха поставени:

1. получаване на инсулин в биотехнологията

2. Начини за получаване на инсулин

H. Пречистване на инсулина

Историята на откриването на инсулин е свързана с името на руския лекар И.М. Соболев (втората половина на 19-ти век), който доказа, че нивото на захар в човешката кръв се регулира от специален хормон на панкреаса.

През 1922 г. инсулин, изолиран от панкреаса на животно, се въвежда за десетгодишно момче за първи път, диабетик надмина всички очаквания, а година по-късно американската компания Eli Lilly пуска първия животински инсулинов препарат.

След получаването на първата индустриална партида инсулин през следващите няколко години се пресича огромен начин за неговото изолиране и пречистване. В резултат на това хормонът стана достъпен за пациенти с диабет тип 1.

През 1935 г. датският изследовател Hagedorn оптимизира действието на инсулина в организма, като предлага продължително лечение.

Първите инсулинови кристали са получени през 1952 г., а през 1954 г. английският биохимик Г. Сенгер дешифрира структурата на инсулина. Разработването на методи за пречистване на хормона от други хормонални вещества и продукти на инсулинова деградация направи възможно получаването на хомогенен инсулин, наречен еднокомпонентен инсулин.

В началото на 70-те години. Съветски учени А. Yudaev и S. Shvachkin предложи химически синтез на инсулин, обаче, прилагането на този синтез в промишлен мащаб е скъпо и нерентабилно.

В бъдеще се наблюдава прогресивно подобряване на степента на пречистване на инсулините, което намалява проблемите, причинени от инсулинови алергии, нарушена бъбречна функция, зрително увреждане и имунна инсулинова резистентност. Най-ефективният хормон е необходим за заместителна терапия при захарен диабет - хомоложен инсулин, т.е. човешки инсулин.

През 80-те години напредъкът в молекулярната биология дава възможност да се синтезират и двете човешки инсулинови вериги, използващи E.coli, които след това се обединяват в биологично активна хормонална молекула, и рекомбинантният инсулин се получава чрез генетично инженерни щамове на E.coli в Института по биоорганична химия.

2. Получаване на инсулин в биотехнологията

Инсулин, пептиден хормон на панкреатичните острови на Лангерханс, е основното лечение за захарен диабет. Това заболяване се дължи на дефицит на инсулин и се проявява чрез повишаване на нивата на кръвната захар. Доскоро инсулин беше получен от панкреаса на бик и прасе. Лекарството се различава от човешки инсулин замествания с 1-3 аминокиселини, така че има заплаха от алергични реакции, особено при деца. Мащабната терапевтична употреба на инсулин беше ограничена от високата му цена и ограничените ресурси. Чрез химическа модификация инсулин от животни се прави неразличим от човека, но това означава допълнително увеличение на цената на продукта [1].

От 1982 г. Eli Lilly произвежда генетично модифициран инсулин на базата на отделен синтез на E. colie - и B-вериги. Цената на продукта е намаляла значително, произведеният инсулин е идентичен с човешкия. От 1980 г. в пресата има съобщения за клонирането на проинсулиновия ген, прекурсор на хормона, който преминава в зряла форма с ограничена протеолиза.

Технологията на капсулиране е свързана и с лечението на диабет: клетките на панкреаса в капсула, въведени веднъж в тялото на пациента, произвеждат инсулин в рамките на една година.

Интегрираната генетика стартира производството на фоликулостимулиращи и лутеинизиращи хормони. Тези пептиди са съставени от две субединици. На дневен ред е въпросът за индустриалния синтез на олигопептидни хормони на нервната система, анефалини, изградени от 5 аминокиселинни остатъка, и ендорфини, аналози на морфина. С рационално използване на тези пептиди облекчаване на болката, създаване на добро настроение, повишаване на ефективността, концентриране на вниманието, подобряване на паметта, да подредят съня и будността. Пример за успешното прилагане на методите на генното инженерство е синтеза на β-ендорфин, използвайки хибридната протеинова технология, описана по-горе за друг пептиден хормон, соматостатин [2].

3. Начини за получаване на човешки инсулин

Исторически погледнато, първият начин за получаване на инсулин за терапевтични цели е да се изолират аналози на този хормон от естествени източници (панкреасни островчета на говеда и свине). През 20-те години на миналия век е установено, че говежди и свински инсулини (които са най-близки до човешкия инсулин по структура и аминокиселинна последователност) показват активност в човешкото тяло, която е сравнима с човешкия инсулин. След това дълго време се използва говежди или свински инсулин за лечение на пациенти с диабет тип 1. Въпреки това, след известно време, беше показано, че в някои случаи, антитела срещу говежди и свински инсулини започват да се натрупват в човешкото тяло, като по този начин унищожават техните ефекти.

От друга страна, едно от предимствата на този метод за получаване на инсулин е наличието на суровини (говежди и свински инсулин могат лесно да се получат в големи количества), което играе решаваща роля в разработването на първия метод за получаване на човешки инсулин. Този метод се нарича полусинтетичен [3].

При този метод за производство на човешки инсулин като суров материал се използва свински инсулин. Пречистеният свински инсулин се разцепва от С-крайния октапептид на В-веригата, след което се синтезира С-крайният октапептид на човешки инсулин. След това беше химически свързан, защитните групи бяха отстранени и полученият инсулин беше пречистен. При тестване на този метод за получаване на инсулин беше показана пълната идентичност на получения хормон с човешки инсулин. Основният недостатък на този метод е високата цена на получения инсулин (дори сега химичният синтез на октапептид е скъп, особено в промишлен мащаб).

Понастоящем човешкият инсулин се получава главно по два начина: чрез модифициране на свинския инсулин чрез синтетичен ензимен метод и чрез метод на генно инженерство.

В първия случай методът се основава на факта, че свинският инсулин се различава от човешкия инсулин чрез еднократно заместване в С-края на А-А130Т-В В-веригата. Замяната на аланин с треонин се извършва чрез ензимно-катализирано разцепване на аланин и вместо това се прикрепя карбоксил-защитен треонинов остатък, присъстващ в реакционната смес в голям излишък. След разцепване на защитната О-трет-бутилова група се получава човешки инсулин. (снимка 1)

Фигура 1 - Схема на методите за производство на човешки инсулин

Инсулинът е първият протеин, получен за търговски цели, използвайки рекомбинантна ДНК технология. Съществуват два основни подхода за получаване на генетично модифициран човешки инсулин. В първия случай, отделните (различни продуктови щамове) произвеждат и двете вериги, последвани от сгъването на молекулата (образуването на дисулфидни мостове) и отделянето на мизоформата. Във втория, препарат под формата на прекурсор (проинсулин), последван от ензимно разцепване с трипсин и карбоксипептидаза. В активната форма на хормона. Най-предпочитано в момента е производството на инсулин като прекурсор, осигуряващ правилното затваряне на дисулфидните мостове (в случай на разделно производство на вериги, последователни цикли на денатуриране, разделяне на мизоформата и ренатурация [3]).

В двата подхода е възможно както индивидуално да се получат изходните компоненти (А и В вериги, или проинсулин), и като част от хибридните протеини. В допълнение към А- и В-веригите или проинсулина, може да присъства в състава на хибридните протеини:

1) протеин-носител - осигуряване на транспорта на хибридния протеин в периплазменото пространство на клетката или културалната среда;

2) афинитетен компонент - значително улеснява селекцията на хибриден протеин.

В същото време и двата компонента могат да присъстват едновременно в състава на хибридния протеин. Освен това при създаването на хибридни протеини може да се използва принципът на многомерност (т.е. няколко копия на целевия полипептид присъстват в хибридния протеин), което прави възможно значително да се увеличи добива на целевия продукт [4].

Използвахме щама JM 109 N1864 с нуклеотидна последователност, вградена в плазмид, експресиращ хибриден протеин, който се състои от линеен проинсулин и фрагмент от протеинов фрагмент на Astaphylococcusaureus, свързан с неговия N-край чрез метионинов остатък. Култивирането на наситената биомаса на клетките от рекомбинантния щам осигурява началото на производството на хибридния протеин, изолирането и последователната трансформация на които чрез интубирането води до инсулин. Друга група изследователи получи в бактериалната експресионна система слят рекомбинантен протеин, състоящ се от човешки проинсулин и полихистидинова опашка, прикрепен към него чрез метионинов остатък. Изолира се като се използва хелатна хроматография върху Ni-агарозни колони от включени тела и се усвоява с цианоген бромид. Авторите установяват, че изолираният протеин е S-сулфуриран. Картографирането и масспектрометричният анализ на получения проинсулин, пречистен чрез йонообменна хроматография върху анионообменник и RP (обратна фаза) HPLC (високоефективна течна хроматография), показва наличието на дисулфидни мостове, съответстващи на дисулфидните мостове от естествен човешки проинсулин. Той също така докладва за разработването на нов, подобрен метод за получаване на човешки инсулин чрез методи за генно инженерство в прокариотни клетки. Авторите установяват, че полученият по своята структура и биологична активност инсулин е идентичен с хормона, изолиран от панкреаса [5].

Напоследък се обръща голямо внимание на опростяването на процедурата за производство на рекомбинантен инсулин чрез методи за генно инженерство. По този начин, чрез лизинов остатък се получава слят протеин, състоящ се от интерлевкинов лидер пептид, прикрепен към N-края на проинсулин. Протеинът е ефективно експресиран и локализиран в включените тела. След изолиране протеинът се разцепва с трипсин, за да се получи инсулин и С-пептид. Друга група изследователи е действала по подобен начин. Слят протеин, състоящ се от проинсулин и два синтетични домена на Staphylococcus протеин А, който свързва IgG, е локализиран в включените тела, но има по-високо ниво на експресия. Протеинът се изолира чрез афинитетна хроматография при използване на IgG и се третира с трипсин и карбоксипептидаза B. Полученият инсулин и С-пептид се пречистват чрез RP-HPLC. При създаване на фузионни структури, масовото съотношение на протеиновия носител към целевия полипептид е много важно. Това е начинът, по който е описано конструирането на фузионни конструкции, където протеин, който свързва човешкия серумен албумин, се използва като носител полипептид. Към него са прикрепени един, три и седем С-пептида. С-пептидите се комбинират на основата на главата-опашка, използвайки аминокиселинни спейсери, носещи Sfi I рестрикционния сайт и два аргининови остатъка в началото и в края на спейсера за последващо разцепване на протеина с трипсин. Продуктите за HPLC разцепване показват, че С-пептидът се разцепва количествено и това позволява използването на метода на мултимерни синтетични гени за получаване на целеви полипептиди в промишлен мащаб.

Получаване на мутант проинсулин, който съдържа заместването на Arg32Tyr. Със съвместното разцепване на този протеин с трипсин и карбоксипептидаза В, се образува естествен инсулин и С-пептид, съдържащ тирозинов остатък. Последният, след 125I маркиране, се използва активно в радиоимуноанализ [6].

Контрол на качеството на инсулина

Съдържанието

1. Обща информация за получаване на инсулин 5

2. Методи, използвани за контрол на качеството на инсулин 8

Референции 17

Извадка от работа

1-2% от европейското население страда от диабет, а около 20% от тези пациенти не могат да съществуват без инжекции с инсулин. След първите опити за използване на инсулин за лечение на диабет през 1922 г. този хормон е изолиран от панкреаса на животни (крави и прасета). Животинският инсулин е малко по-различен в аминокиселинната последователност от човешки инсулин.

Особено близки са човешките и свинските инсулини: при свински инсулин С-терминалът на В-веригата е заменен с аланин. Краве и човешки инсулин се различават по три аминокиселинни остатъка. Именно тези различия определят повишената имуногенна активност на волски инсулин в сравнение с прасения инсулин.

Почти всички пациенти, лекувани с кравешки инсулин, имат антитела срещу инсулин в кръвта. Антигенните свойства на инсулина също се определят частично от примесите в неговите препарати. Най-вероятно образуването на антитела към инсулина обяснява някои незначителни странични ефекти при инжектиране на инсулин от крава, например атрофия на подкожната мастна тъкан в мястото за повторно инжектиране. В случай на високо пречистен инсулин, тези ефекти отсъстват.

Впоследствие, благодарение на генното инженерство и използването на Е. Coli, беше получен човешки инсулин.

Човешкият инсулин, получен от Е. coli, е първият "генетично модифициран" протеин, тестван при хора. При експерименти със здрави доброволци беше установено, че той е безопасен (не предизвиква алергични и други нежелани реакции) и има способността да намалява нивото на глюкозата в кръвта, когато се прилага под кожата или интравенозно.

Понастоящем такъв човешки инсулин се получава от много диабетици по света. Това е предшествано от клинични проучвания, при които са изследвани метаболитни промени и имунологични ефекти.

Значението на нашата тема е, че неконтролираното или лошо контролирано производство може да доведе до освобождаване на замърсени инсулинови препарати, което от своя страна може да доведе до неблагоприятни клинични последици.

Целта на тази работа е да се проучат методите, използвани при контрола на качеството на инсулина.

Позоваването

ГОСТ Р 52249-2004 "Правила за производство и контрол на качеството на лекарствата" 2004

OFS 42-0002-00 „Бактериални ендотоксини“ 2000

OFS 42-0126-09 "Биологично изследване на инсулин"

Фармакопейна статия на Руската федерация FS 42-2620-97. 1997

Байрамашвили Д.И. Генетично инженерство на човешки инсулин: успехи и перспективи // Руски химически журнал. - 2005. - Т. XLIX. - № 1. - стр. 34-45.

Гончаренко Г.Г. Основи на биотехнологията: Метод на преподаване. комплекс за stud.biolog. спец. / G.G. Гончаренко, А.В. Крук, Е.М. Степанова, А.А. Surkov, S.A. Zyatkov; Мин. Пр. RB. - Гомел: EI “GGU im.F. Скарина, 2008. - 282 с.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Приложение на кинетично-хромогенния метод за определяне на бактериален ендотоксин (ЛАЛ-тест) в технологията за пречистване на генетично модифициран човешки инсулин // Биофармацевтично списание - 2009. - том 1. - №1. - стр. 34-37.